CRISPR-Cas9 editing e sua applicazione per ottenere piante di pomodoro tolleranti alla peronospora

Negli ultimi decenni le conoscenze acquisite nel campo della biologia molecolare hanno permesso di affiancare alle tecniche tradizionali di plant breeding, tecniche basate sulla trasformazione genetica tramite vettori plasmidici o biolistica. Inoltre, la ricerca nel campo delle biotecnologie ha portato alla scoperta di altre tecniche di manipolazione genetica, tra cui il ‘Gene Editing’. Quest’ ultima ha consentito e consentirà di aumentare la resa e le proprietà qualitative e nutraceutiche delle piante di interesse agroalimentare, nonché la resistenza/tolleranza a stress biotici e abiotici. L’editing del genoma consente di modificare con grande precisione una sequenza di DNA, introducendo artificialmente delle mutazioni in punti specifici del genoma che causano il blocco dell’espressione di un gene o di inserire in una specifica sequenza del DNA una correzione o una nuova sequenza. La tecnica sfrutta due meccanismi naturali: la restrizione del DNA da parte di nucleasi specifiche e la capacità del DNA di attuare meccanismi di riparazione quali la giunzione di estremità non omologhe (NHEJ) e la ricombinazione omologa (HR). Tra le tecniche di editing attualmente disponibili, CRISPR-Cas9 è quella più utilizzata e nelle piante è stata principalmente sfruttata per guidare la nucleasi Cas9 da un RNA guida (sgRNA) in una regione specifica del genoma allo scopo di effettuare un taglio nel DNA che, a seguito di errori nei meccanismi di riparazione della cellula, induce una mutazione causando la disattivazione (knock out) di un gene. Nelle piante sono presenti geni che facilitano l'infezione da parte di patogeni e sono definiti geni di suscettibilità (S), la cui disattivazione o perdita può limitare la capacità di un agente patogeno di causare una malattia. Il caso studio preso in esame ha avuto come obiettivo lo knock out di un gene di suscettibilità SlPMR4, in due cv commerciali di pomodoro ‘San Marzano’ e ‘Cuore di bue’, entrambe suscettibili al patogeno Phytophthora infestans agente della peronospora. La malattia causa la comparsa di macchie dapprima grigio verdi e poi marroni sulle foglie e sui frutti che si espandono molto velocemente e causano una drastica riduzione quali-quantitativa del prodotto. Per la trasformazione delle cellule vegetali, è stato utilizzato un vettore plasmidico di Agrobacterium thumefaciens contenente le sequenze codificanti per l’endonucleasi Cas9 e per quattro sgRNA (sgRNA1,6,7 e 8) in grado di riconoscere altrettante sequenze del gene ed aumentare l’efficacia del knock out. I diversi sgRNA hanno indotto inserzioni e delezioni a carico del DNA con una frequenza di mutazione variabile dal 22 al 100%. In particolare sgRNA7 ha indotto in 7 genotipi SM una delezione in omozigosi di 7 bp, mentre sgRNA8 ha prodotto 15 genotipi SM con una mutazione biallelica di -7 e -2bp. Quattro genotipi SM, in cui il gene SlPMR4 era stato completamente disattivato, sono state inoculate con P. infestans ed hanno evidenziato una marcata riduzione nella manifestazione dei sintomi della malattia sino all’80% rispetto a piante controllo non editate. Il sequenziamento delle 4 linee ha confermato l’assenza di mutazioni off-target a carico del DNA. I risultati ottenuti evidenziano che il gene SlPMR4 svolge pertanto un ruolo chiave nel favorire l’interazione del patogeno con la pianta. I risultati ottenuti confermano le potenzialità della tecnica per lo sviluppo di cultivar tolleranti a patogeni con l’obiettivo di ridurre l'uso di fitofarmaci.