Sviluppo di metodi LC-MS e GC-MS per la determinazione selettiva di glucosinolati ed isotiocianati nella famiglia delle Brassicacee

Glucosinolates are secondary metabolites of plants, which are found in very high concentrations particularly in the Brassicaceae (or Cruciferae) family and are known to have beneficial effects on the human body. This is why interest in these compounds for the development of nutraceuticals and food supplements has become increasingly important in recent years. Within the plant matrix is also present the enzyme myrosinase, which under mechanical stress or due to temperature is activated and breaks down the glucosinolates, favouring the formation of isothiocyanates. The aim of this work was to develop mass spectrometric methods to obtain the selective identification of both intact glucosinolates and their isothiocyanates, with the further aim that these methods would be applicable to a variety of species belonging to the same family. In the case of the glucosinolates, it was necessary to block the action of the enzyme myrosinase, which is why in the sample preparation the samples were treated with liquid nitrogen. A method was then constructed in LC-MS/MS, performing a Precursor Ion Scan, in order to identify the masses corresponding to glucosinolates, supported by a literature search. The precursor ion scan experiment provided a selective analysis of the class of compounds, also allowing a semi-untargeted approach to search for unknown or less abundant glucosinolates. Subsequently, high-resolution analyses were performed using an Orbitrap Fusion Triibrid UHPLC to confirm the masses found. In the case of isothiocyanates, the purpose was precisely to promote the action of the enzyme, so liquid nitrogen was not used, and different conditions were tested. A dichloromethane extraction was also performed to be able to perform GC-MS analysis with direct infusion, as isothiocyanates are volatile compounds. Moreover an LC-MS/MS method employing an MRM approach was developed to determine and quantify the sulforaphane. The next steps could be to optimise the proposed methods and to validate them, improving the quantification part; furthermore, a study on the correlation between plant maturation and the concentration of the compounds of interest would be desirable. ​

I glucosinolati sono metaboliti secondari delle piante, che si trovano in concentrazioni molto elevate soprattutto nella famiglia delle Brassicaceae (o Cruciferae) e sono noti per i loro effetti benefici sull'organismo umano. Per questo motivo, negli ultimi anni l'interesse per questi composti per lo sviluppo di nutraceutici e integratori alimentari è diventato sempre più importante. All'interno della matrice vegetale è presente anche l'enzima mirosinasi, che sotto stress meccanico o a causa della temperatura si attiva e scinde i glucosinolati, favorendo la formazione di isotiocianati. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di sviluppare metodi di spettrometria di massa per ottenere l'identificazione selettiva sia dei glucosinolati intatti che dei loro isotiocianati, con l'ulteriore obiettivo che questi metodi fossero applicabili a una varietà di specie appartenenti alla stessa famiglia. Nel caso dei glucosinolati, è stato necessario bloccare l'azione dell'enzima mirosinasi, motivo per cui nella preparazione dei campioni questi sono stati trattati con azoto liquido. È stato quindi costruito un metodo in LC-MS/MS, eseguendo un Precursor Ion Scan, per identificare le masse corrispondenti ai glucosinolati, con il supporto di una ricerca in letteratura. L'esperimento in Precursor Ion Scan ha fornito un'analisi selettiva della classe di composti, consentendo anche un approccio semi-targeted alla ricerca di glucosinolati sconosciuti o meno abbondanti. Successivamente, sono state eseguite analisi ad alta risoluzione utilizzando un Orbitrap Fusion Triibrid UHPLC per confermare le masse trovate. Nel caso degli isotiocianati, lo scopo era proprio quello di promuovere l'azione dell'enzima, quindi non è stato utilizzato azoto liquido e sono state testate diverse condizioni. È stata eseguita anche un'estrazione con diclorometano per poter eseguire l'analisi GC-MS con infusione diretta, poiché gli isotiocianati sono composti volatili. Oltre a ciò è stato sviluppato un ulteriore metodo in LC-MS/MS con un approccio in MRM per la determinazione e la successiva quantificazione del sulforafano. I prossimi passi potrebbero essere l'ottimizzazione dei metodi proposti e la loro validazione, migliorando la parte di quantificazione; inoltre, sarebbe auspicabile uno studio sulla correlazione tra la maturazione della pianta e la concentrazione dei composti di interesse. ​