Riduzione enantioselettiva di immine e amminazione riduttiva promossa da imminoreduttasi (IRED) in solventi non convenzionali

Chiral amines represent fundamental building blocks in the pharmaceutical industry due to the high number of active pharmaceutical ingredients (APIs) in which they are present. For this reason, interest has grown in recent decades for the development of green protocols aimed at synthesising chiral amines, with a particular emphasis on biocatalytic processes. Enzymes indeed enable the synthesis of enantiomerically pure molecules by operating under mild reaction conditions, in aqueous media, reaching high levels in terms of chemo-, regio- and stereoselectivity. Nevertheless, their application in organic syntheses is often inefficient due to the low solubility of many organic compounds in aqueous media. Consequently, unconventional green solvents such as Deep Eutectic Solvents and glycerol have been suggested as alternative or complementary solvents for biocatalytic reactions. The aim of this thesis project is to explore the effectiveness of non-commercial imine reductases (IREDs) in non-conventional green solvents. IREDs represent a recent class of NADPH-dependent enzymes crucial for the enantioselective synthesis of amines through the reduction of cyclic imines or reductive amination. The IREDs used were obtained through bacterial expression and applied in the form of freeze-dried cell extracts. 5-, 6-, and 7-membered cyclic imines were synthetized. The asymmetric reduction of these imines was performed by optimizing reaction conditions into mixtures of glycerol and phosphate buffer as reaction solvents. Also, an enzymes screening was performed in order to identify the best one for each substrate. The experimental focus was also extended to the reductive amination catalyzed by these IREDs. Specifically, a screening of diverse model substrates, including ketones, aldehydes, and amines, was conducted to obtain the corresponding imines. The application of non-commercial IREDs in the asymmetric reduction of cyclic imines and in reductive amination has led to positive results with good yields in unconventional mixtures of glycerol and phosphate buffer, opening up prospects for further investigations.

Le ammine chirali rappresentano dei building blocks fondamentali nell’industria farmaceutica dato l’alto numero di active pharmaceuticals ingredients (APIs) in cui sono presenti. Per questo motivo negli ultimi decenni è emerso l’interesse nello sviluppo di protocolli green per la sintesi di ammine chirali con particolare attenzione verso i processi biocatalitici. Gli enzimi, infatti, permettono la sintesi di molecole enantiomericamente pure operando in condizioni di reazione blande, a pressione atmosferica e a temperatura inferiori a 100 °C, in ambiente acquoso, raggiungendo alti livelli in termini di chemo-, regio- e stereoselettività. Tuttavia, il loro utilizzo nelle sintesi organiche risulta spesso inefficiente a causa della bassa solubilità di molti composti organici in acqua. A questo proposito, come solventi alternativi o ausiliari per le reazioni biocatalitiche sono stati proposti solventi green non convenzionali tra i quali i Deep Eutectic Solvent e il glicerolo. Lo scopo del seguente progetto di tesi è indagare l’efficacia di immino reduttasi (IRED) non commerciali in solventi green non convenzionali. Le IRED sono una recente classe di enzimi NADPH-dipendenti che svolgono un ruolo chiave nella sintesi enantioselettiva di ammine tramite la riduzione di immine cicliche, o mediante amminazione riduttiva. Le IRED adoperate sono state ottenute mediante espressione batterica ed utilizzate sottoforma di estratti cellulari liofilizzati. Nello specifico sono state sintetizzate immine cicliche a 5, 6 e 7 termini, è stata studiata la riduzione asimmetrica di tali ammine ottimizzando le condizioni di reazione e l’enzima in base al substrato scelto ed utilizzando miscele di glicerolo e tampone fosfato come solventi di reazione. Il lavoro sperimentale si è anche focalizzato sull’amminazione riduttiva promossa da tali IRED, in particolare è stato effettuato uno screening di vari substrati modello, chetoni, aldeidi e ammine al fine di ottenere i prodotti di amminazione riduttiva. L’utilizzo di IRED non commerciali in miscele di glicerolo e tampone fosfato, ha portato ad esiti di reazione positivi, sia nel caso delle reazioni di riduzione asimmetrica di immine cicliche che nel caso di reazioni di amminazione riduttiva.