The practice of biocontrol has become the promising approach in the sustainable agriculture, using living organisms against the plant pathogens through specific mechanisms. The aim of this study was exploiting new natural antagonistic microorganisms such as epiphytic yeasts in order to reduce fungal damage and disease spreading. The yeasts have been isolated from Georgian Vitis vinifera ssp. sylvestris and ssp. vinifera and have been used to evaluate their potential activity against the pathogenic fungi Botrytis cinerea, Aspergillus carbonarius and Penicillium expansum. To estimate the inhibitory ability different tests were performed. After the first in vivo screening on infected berries, to assess the interplay grape-mould?yeast, 19 yeast strains out of 38 have shown positive results and their identification step was carried out. The biocontrol activity was then analysed in vitro, using dual-culture plate and double petri dish tests, this last specifically to assay the production of volatile organic compounds (VOCs). Pichia kudriavzevii UMY 1470, Clavispora lusitaniae UMY 1471, Candida intermedia UMY 189, Cystofilobasidium infirmomiatum UMY 205 and Aureobasidium pullulans UMY 201 demonstrated the best antagonistic activity in dual-culture plate assays, while 100% inhibition was detected using Pichia terricola UMY 197, Pichia kluyveri UMY 210, several Saccharomyces cerevisiae strains against the 3 pathogens and P. kudriavzevii UMY 1470 against P. expansum and B. cinerea in double Petri dish tests. Considering these last results, SPME/GC-mass spectrometry was used to verify the VOCs production and the most prominent was found to be S. cerevisiae UMY 1430 against all pathogens in this study. Its inhibitor ability more likely can be correlated to the production of 2-phenylethyl ester, oxalic acid, ethyl acetate, heptanoic acid ethyl ester. In order to evaluate a possible future application in agriculture and winemaking, tolerance to copper, to a commercial fungicide and to sulphur dioxide of the 19 yeasts were tested as well. Candida intermedia UMY 189, Aureobasidium pullulans UMY 201, Metschnikowia pulcherrima UMY 1472 and Saccharomyces cerevisiae UMY 1423 were the most resistant to copper exposure. Only 3 yeast strains (P. terricola, M. pulcherrima and H. paragotoi) out of 19 has demonstrated intolerance to the chemical fungicide SWITCH (Syngenta, 37,5% Cyprodinil 25% Fludioxonil) up to 1 g/L concentration; other 16 strains were relatively resistant to the fungicide, while on the Grape Juice Medium only P. kudriavzevii UMY 1470 and C. lusitaniae UMY 1471 exhibited an insensitive response to the fungicide. Additionally, the analyse on sulphur resistance using the Cabernet Sauvignon grape juice, containing 50 mg/L 5 SO2, showed that all yeast strains were sensitive to the sulphur dioxide and therefore, their utilization in the agricultural practices could not influence further during the vinification processes. In conclusion, the inhibitory activity of the analysed yeasts proved to be promising. Future in field experiments will allow to fully examine their biocontrol potential.
La pratica del biocontrollo è diventata l'approccio promettente nell'agricoltura sostenibile, utilizzando gli organismi viventi contro i patogeni delle piante attraverso specifici meccanismi. Lo scopo di questo studio è stato quello di sfruttare nuovi microrganismi antagonisti naturali, come i lieviti epifiti, al fine di ridurre i danni e la diffusione di malattie fungine. I lieviti sono stati isolati da Vitis vinifera ssp. sylvestris e ssp. vinifera di origine georgiana e sono stati utilizzati per valutare la loro potenziale attività antagonista nei confronti di funghi patogeni delle specie Botrytis cinerea, Aspergillus carbonarius e Penicillium expansum. Per stimare la capacità inibitoria da parte dei ceppi di lievito scelti sulla malattia, sono state eseguite diverse prove. Dopo il primo screening in vivo su acini infettati, per valutare l'interazione uva-muffa-lievito, 19 ceppi di lievito su 38 hanno dato esito positivo ed è stata effettuata la loro identificazione. L'attività di biocontrollo è stata quindi analizzata in vitro, utilizzando il dual-test su strato solido ed il test a doppio-stato in sandwich, quest’ultimo adatto a rilevare la produzione di composti organici volatili (VOCs). Pichia kudriavzevii UMY 1470, Clavispora lusitaniae UMY 1471, Candida intermedia UMY 189, Cystofilobasidium infirmomiatum UMY 205 E Aureobasidium pullulans UMY 201 hanno dimostrato la migliore attività antagonista nel dual-test, mentre l'inibizione del 100% è stata rilevata utilizzando Pichia terricola UMY 197, Pichia kluyveri UMY 210, maggior parte dei Saccharomyces cerevisiae contro i 3 patogeni e P. kudriavzevii UMY 1470 contro P. expansum e B. cinerea nei test doppio?stato in sandwich. Considerando quest’ultimo risultato, l’analisi in spettrometria di SPME/GC è stata utilizzata per verificare la produzione di VOCs. Il più prometente è risultato di essere S. cerevisiae UMY 1430 contro tutti i patogeni. La sua capacità inibitrice è più probabilmente correlabile alla produzione di 2-feniletil estere, acido ossalico, acetato di etile, estere etilico dell'acido eptanoico. 7 Per valutare una possibile futura applicazione in agricoltura ed enologia, è stata analizzata la tolleranza al rame, ad un fungicida commerciale e all'anidride solforosa dei 19 lieviti selezionati. Candida intermedia UMY 189, Aureobasidium pullulans UMY 201, Metschnikowia pulcherrima UMY 1472 e Saccharomyces cerevisiae UMY 1423 sono risultati i più resistenti all'esposizione al rame. Solo 3 ceppi di lievito (P. Terricola, M. pulcherrima e Hypopichia paragotoi) hanno dimostrato intolleranza al fungicida chimico SWITCH (Syngenta, 37,5% Cyprodinil 25% Fludioxonil) fino alla concentrazione di 1 g/L; i restanti 16 ceppi sono risultati relativamente resistenti al fungicida, mentre sul Grape Juice Medium solo P. kudriavzevii UMY 1470 e C. lusitaniae UMY 1471 hanno mostrato una risposta insensibile al fungicida. Inoltre, l'analisi sulla resistenza all’SO2 a dosi enologiche (50 mg/L SO2), utilizzando mosto d'uva Cabernet Sauvignon, ha mostrato che tutti i ceppi di lievito erano sensibili all’antimicrobico. In conclusione, l'attività inibitoria dei lieviti analizzati si è dimostrata promettente; esperimenti in campo consentiranno di confermare il loro potenziale di biocontrollo.
Lieviti associati all'uva isolati in Georgia come agenti di biocontrollo contro i funghi patogeni
MAGHRADZE, TAMAR
2021/2022
Abstract
La pratica del biocontrollo è diventata l'approccio promettente nell'agricoltura sostenibile, utilizzando gli organismi viventi contro i patogeni delle piante attraverso specifici meccanismi. Lo scopo di questo studio è stato quello di sfruttare nuovi microrganismi antagonisti naturali, come i lieviti epifiti, al fine di ridurre i danni e la diffusione di malattie fungine. I lieviti sono stati isolati da Vitis vinifera ssp. sylvestris e ssp. vinifera di origine georgiana e sono stati utilizzati per valutare la loro potenziale attività antagonista nei confronti di funghi patogeni delle specie Botrytis cinerea, Aspergillus carbonarius e Penicillium expansum. Per stimare la capacità inibitoria da parte dei ceppi di lievito scelti sulla malattia, sono state eseguite diverse prove. Dopo il primo screening in vivo su acini infettati, per valutare l'interazione uva-muffa-lievito, 19 ceppi di lievito su 38 hanno dato esito positivo ed è stata effettuata la loro identificazione. L'attività di biocontrollo è stata quindi analizzata in vitro, utilizzando il dual-test su strato solido ed il test a doppio-stato in sandwich, quest’ultimo adatto a rilevare la produzione di composti organici volatili (VOCs). Pichia kudriavzevii UMY 1470, Clavispora lusitaniae UMY 1471, Candida intermedia UMY 189, Cystofilobasidium infirmomiatum UMY 205 E Aureobasidium pullulans UMY 201 hanno dimostrato la migliore attività antagonista nel dual-test, mentre l'inibizione del 100% è stata rilevata utilizzando Pichia terricola UMY 197, Pichia kluyveri UMY 210, maggior parte dei Saccharomyces cerevisiae contro i 3 patogeni e P. kudriavzevii UMY 1470 contro P. expansum e B. cinerea nei test doppio?stato in sandwich. Considerando quest’ultimo risultato, l’analisi in spettrometria di SPME/GC è stata utilizzata per verificare la produzione di VOCs. Il più prometente è risultato di essere S. cerevisiae UMY 1430 contro tutti i patogeni. La sua capacità inibitrice è più probabilmente correlabile alla produzione di 2-feniletil estere, acido ossalico, acetato di etile, estere etilico dell'acido eptanoico. 7 Per valutare una possibile futura applicazione in agricoltura ed enologia, è stata analizzata la tolleranza al rame, ad un fungicida commerciale e all'anidride solforosa dei 19 lieviti selezionati. Candida intermedia UMY 189, Aureobasidium pullulans UMY 201, Metschnikowia pulcherrima UMY 1472 e Saccharomyces cerevisiae UMY 1423 sono risultati i più resistenti all'esposizione al rame. Solo 3 ceppi di lievito (P. Terricola, M. pulcherrima e Hypopichia paragotoi) hanno dimostrato intolleranza al fungicida chimico SWITCH (Syngenta, 37,5% Cyprodinil 25% Fludioxonil) fino alla concentrazione di 1 g/L; i restanti 16 ceppi sono risultati relativamente resistenti al fungicida, mentre sul Grape Juice Medium solo P. kudriavzevii UMY 1470 e C. lusitaniae UMY 1471 hanno mostrato una risposta insensibile al fungicida. Inoltre, l'analisi sulla resistenza all’SO2 a dosi enologiche (50 mg/L SO2), utilizzando mosto d'uva Cabernet Sauvignon, ha mostrato che tutti i ceppi di lievito erano sensibili all’antimicrobico. In conclusione, l'attività inibitoria dei lieviti analizzati si è dimostrata promettente; esperimenti in campo consentiranno di confermare il loro potenziale di biocontrollo.| File | Dimensione | Formato | |
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