Caratterizzazione degli effetti indotti da Cannabidiolo e Antagonisti del recettore dell'angiotensina II e il loro potenziale sinergismo farmacologico in un modello in vitro di infiammazione neurogena

Microglial cells have a phagocytic activity and have, in the Central Nervous System, a primary role in fighting against infections. After the stimulation, they can be activated in two opposite physiological roles, defined as M1 (neuro-toxic) and M2 (neuro-protective). The persistent activation to M1 contributes to the development of a low degree inflammation (neurogenic inflammation) that is involved in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. NLRP3 Inflammasome (a protein complex that allows to the synthesis and maturation of IL1B and IL18) and the Mitogen Activated Protein Kinases MAPKs (p38, p42/44 and SAPK/JKN isoforms) are among the main signal pathways involved in the neurogenic inflammation. The Angiotensin II Receptors Blockers are used as antihypertensive drugs and recent studies demonstrated their capacity of interfere with the synthesis of inflammatory mediators, in particular cytokines as IL1B and TNFa, in experimental in vitro models of neurogenic inflammation. A reduction of TNFa and IL1B cytokines was also demonstrated as a consequence of treatment of microglial cells with Cannabidiol, the non-psychoactive active principle of Cannabis phytocomplex. The mechanism used by ARBs and Cannabidiol to modulate neurogenic inflammation is not fully elucidated. Therefore, this research project aims to study the molecular mechanism underlying the protective effects induced by ARBs and Cannabidiol and evaluate their potential synergic effect. The project was realized in collaboration with the research group of Prof. Shimon Ben-Shabat, Ph.D. University of the Negev, Beer-Sheva, Israel. BV2 microglial cells were incubated 24 hours at 37°C with LPS 7 ng/mL, and Telmisartan, Losartan, Candesartan, CBD (5 uM). Cellular extracts were processed by Western Blot technique. The results are discussed in this thesis project. The treatment of BV2 with LPS determined a doubling in NLRP3 levels' expression than the control group. The presence of CBD caused an inhibition in NLRP3 expression of about the 50%. Telmisartan and Losartan reduced the expression of NLRP3, in the experimental condition respectively of 90% and 80% compare to the LPS group. The inhibitory effect of Candesartan did not reach a statistic significance. To verify a synergism or an additivity, the cells, stimulated with LPS, were incubated with CBD with the presence of ARBs. The results showed the absence of additivity and synergism referred to NLRP3, in the experimental condition adopted by us. About the MAPK pathway, the results showed that the phosphorylation of p38 increased after the stimulation with LPS, without statistical significance, that suggest an increased activity of the enzyme. CBD and Telmisartan both caused a trend in the reduction of p38 phosphorylation, but again without additivity or synergic effects. The expression of p38 was not modified by LPS or CBD, whereas Telmisartan and Losartan reduced with statistical significance p38 expression. The same results were obtained with Telmisartan for the MAPKs isoform p42/44. In contrast, the SAPK/JNK was not modified in its expression from no one of the treatment used. Overall, these results demonstrated that the modulatory effects on neurogenic inflammation by CBD, Telmisartan and Losartan are mediated by interferences with NLRP3 and MAPKs pathways, without synergic or additivity effects, at least in our experimental conditions.

Le cellule della microglia sono dotate di capacità fagocitica e svolgono, nel Sistema Nervoso Centrale, un ruolo primario nel combattere le infezioni. In seguito a stimolazione, vanno incontro ad attivazione. Esistono due stati di attivazione, in senso fisiologicamente opposto, definiti M1 (neuro-tossico) ed M2 (neuro-protettivo). La persistente attivazione contribuisce allo sviluppo di una infiammazione di basso grado (infiammazione neurogena) coinvolta nella patogenesi delle malattie neurodegenerative. Tra le principali vie di segnale coinvolte ci sono NLRP3 inflammasoma (complesso proteico che porta alla sintesi delle citochine IL1B e IL-18) e le Mitogen Activated Protein Kinases MAPKs, di cui si identificano tre diverse isoforme: p38, p42/44 e SAPK/JNK. Gli antagonisti del recettore per l'angiotensina II (ARBs) sono usati come farmaci antiipertensivi e recenti studi hanno dimostrato la loro capacità di interferire con la sintesi di mediatori dell'infiammazione, citochine come IL1B e TNFa, in modelli sperimentali in vitro di infiammazione neurogena. Una riduzione di TNFa e IL1B è stata dimostrata in seguito trattamento di cellule di microglia con Cannabidiolo, principio attivo non psicoattivo del fitocomplesso della Cannabis. Il meccanismo con cui ARBs e Cannabidiolo modulano la neuroinfiammazione non è del tutto noto. Pertanto, l'obiettivo del presente progetto di ricerca è stato quello di identificare i meccanismi molecolari sottesi agli effetti protettivi indotti da ARBs e Cannabidiolo e valutare un potenziale loro effetto sinergico. Il progetto è stato realizzato in collaborazione con il gruppo di ricerca del Prof. Shimon Ben-Shabat, Ph.D. University of the Negev, Beer-Sheva, Israel. Cellule BV2 di microglia sono state incubate 24 ore a 37°C con LPS 7 ng/mL, e Telmisartan, Losartan, Candesartan, CBD (5 uM). Gli estratti cellulari sono stati processati mediante Western blot. I risultati sono oggetto del progetto di tesi. Il trattamento di cellule BV2 con LPS determina un raddoppio dei livelli di espressione di NLRP3 rispetto al gruppo controllo. La presenza di CBD causa una inibizione dell'espressione di NLRP3 di circa il 50%. Telmisartan e Losartan riducono l'espressione di NLRP3, rispettivamente del 90% e l'80% rispetto al gruppo LPS. L'effetto inibitorio di Candesartan non raggiunge significatività statistica. Per verificare sinergismo o additività, le cellule, stimolate con LPS, sono state incubate con CBD in presenza di ARBs. I risultati dimostrano l'assenza di additività e sinergismo in riferimento a NLRP3, nelle condizioni sperimentali adottate. Per quanto riguarda le MAPKs, i risultati dimostrano che la fosforilazione di p38 aumenta a seguito dello stimolo con LPS, in modo non statisticamente significativo, suggestivo di una aumentata attività dell'enzima. CBD e Telmisartan causano una tendenza alla riduzione della fosforilazione di p38, nuovamente senza effetti additivi o sinergici. L'espressione di p38 non è modificata da LPS e CBD, mentre Telmisartan e Losartan riducono significativamente l'espressione di p38. Analoghi risultati sono stati ottenuti con Telmisartan per p42/44. Invece SAPK/JNK non viene modificata nella sua espressione da nessuno dei trattamenti. Nell'insieme questi risultati dimostrano che gli effetti di modulazione dell'infiammazione neurogena da parte di CBD, Telmisartan e Losartan sono mediati da interferenze con le vie di segnale di NLRP3 inflammasoma e MAPKs, senza effetti additivi o sinergici.