Sviluppo di un metodo innovativo per la formulazione di nanoparticelle lipidiche solide come potenziali veicoli di farmaci: studi preliminari indirizzati alla terapia dei gliomi

Gliomas are a wide family of primary brain's cancer derived from glials cells. They could be divided into two subcategories: low grade and high grade gliomas. In particular, Glioblastoma Multiforme (fourth grade) represents the most malignant, aggressive and recurrent type. Till now the combination of surgical removal followed by radiotherapy and adjuvant chemotherapy has not shown positive results, because the prognosis is still poor and life's expectation very short. In this thesis project an easy and reproducible formulation's technology has been developed, in order to prepare solid lipid nanoparticles (SLN) as potential drug delivery systems for the pharmacological treatment of gliomas. It is based on PIT (inversed phase temperature) method and it needs only three components: a solid lipid, an O/A emulsifier from the category of sorbitans (Span) and a surfactant from the category of polysorbates (Tween20). These components are mixed with water and than gradually heated under magnetic stirring until the formation of an O/A milky emulsion, that will turn into a clear microemulsion and finally, above the PIT (which corresponds to Tween20's Cloud Point) will revert the phase, thanks to the decrease of water's solubility of Tween and to the presence of Span. Cooling the mixture the same phases, already observed during the heating process, recur in reversed order. Finally, there is the precipitation of SLN under the lipid melting temperature. In order to remove micelles made of the exceeding Tween20, which is haemotoxic, SLN have been purified alternatively with size exclusion or dextran gradient centrifugation. SLN have been characterized with Dynamic Light Scattering (DLS) for particles size, Differential Scanning Calorimeter (DSC) and Field Emission Scanning Electronic Microscope (FESEM). Obtained SLN show sufficiently reduced particle size to overcome the blood brain tumour barrier (BBTB), whose blood vessels, differently to intact blood brain barrier (BBB), are leaky. Furthermore, the presence of polysorbates could facilitate intact BBB overcoming, so as to reach brain adjacent to tumor (BAT) zone, where glioma cells residual from surgery are present, that are responsible for fatal relapses. Afterwards SLN have been loaded with Paclitaxel, an antineoplastic drug, Regorafenib, a kinase inhibitor with antiangiogenic proprieties, and nanoceria, with antioxidant activity. The use of functionally and chemically different substances is justified by the need to act simultaneously on tumor's growth, neo-vascularization, differentiation and migration of tumor cells, which is facilitated by oxidative stress in tumour micorenvironment. Then, preliminary in vitro studies have been performed using drug loaded SLN on F98 rat glioma cells, with encouraging results. Moreover, SLN have been labelled with 6-cumarin, a fluorescent probe, and biodistribution after iv administration to healthy rats has been investigated, obtaining a promising accumulation in brain blood vessels and parenchyma.

I gliomi sono un'ampia famiglia di tumori cerebrali primari originanti da cellule della glia. Si suddividono in due sottocategorie: gliomi di basso grado e di alto grado. Tra questi ultimi il glioblastoma multiforme (quarto grado) rappresenta il tipo maggiormente maligno, aggressivo e recidivo. Ad oggi la combinazione di asportazione chirurgica seguita da radioterapia e chemioterapia adiuvante non dà risultati incoraggianti in quanto la prognosi resta infausta e l'aspettativa di vita estremamente breve. In questo progetto di tesi è stata sviluppata una tecnologia formulativa semplice e riproducibile per la formulazione di nanoparticelle lipidiche solide (SLN), quali veicoli di farmaci per il potenziale trattamento farmacologico dei gliomi. Essa è basata sul metodo PIT (temperatura di inversione di fase), e sfrutta solo tre componenti: un lipide solido, un emulsionante A/O appartenente alla categoria dei sorbitani (Span) ed un tensioattivo appartenente alla categoria dei polisorbati (come il Tween20). Questi componenti vengono miscelati in acqua e riscaldati progressivamente su agitatore magnetico sino a formare un emulsione O/A lattescente, la quale poi si converte in una microemulsione limpida, e infine, al di sopra della PIT (corrispondente al Cloud Point del Tween), inverte la fase, grazie alla diminuzione della solubilità acquosa del Tween e al contributo dello Span. Raffreddando la miscela, si assiste alla ricomparsa, in ordine inverso, delle stesse fasi osservate durante il riscaldamento, per finire con la precipitazione delle SLN al di sotto della temperatura di fusione del lipide. Per rimuovere le micelle dovute al Tween20, il cui eccesso è responsabile di emotossicità, le SLN sono state purificate alternativamente con esclusione molecolare o mediante centrifugazione in gradiente di destrano. Esse sono quindi state caratterizzate tramite il Dynamic Light Scattering (DLS) per il profilo dimensionale, il Differential Scanning Calorimeter (DSC) e il Field Emission Scanning Electronic Microscope (FESEM). Le SLN ottenute presentano dimensioni sufficientemente ridotte da penetrare attraverso la cosiddetta barriera emato tumorale encefalica (BETE), in cui i vasi, a differenza della barriera emato encefalica (BEE) del tessuto sano, sono discontinui. Inoltre la presenza di polisorbati potrebbe favorire anche il superamento della BEE intatta, raggiungendo la cosiddetta zona di cervello adiacente al tumore (BAT), dove si trovano le cellule di glioma residue, non asportate dalla resezione chirurgica, e che sono responsabili delle recidive fatali. Le SLN sono state quindi caricate con farmaci antineoplastici quali il Paclitaxel, agente citostatico, il Regorafenib, inibitore di chinasi ad azione antiangiogenica, e il nanocerio, con azione antiossidante. L'utilizzo di sostanze chimicamente e funzionalmente diverse è giustificata dalla necessità di agire simultaneamente sulla crescita tumorale, sulla neo-vascolarizzazione e sulla differenziazione e migrazione delle cellule tumorali, che è favorita dallo stress ossidativi nel microambiente tumorale. Sono quindi stati condotti studi preliminari in vitro, utilizzando le SLN caricate con farmaci su cellule F98 di glioma di ratto, con risultati incoraggianti. Inoltre le SLN sono state marcate con la 6-cumarina, una sonda fluorescente, e ne è stata valutata la biodistribuzione dopo somministrazione ev a ratti sani, ottenendo un accumulo promettente a livello del parenchima e dei vasi cerebrali.