Pepper (Capsicum annuum L; 2n=2x=24, genome: ~3.5 Gb) belongs to the Solanaceae family, and is a vegetable species cultivated worldwide for both food (fresh consumption) and industrial processing, due to its high content of vitamins and secondary metabolites. The crop has been the subject of multiple breeding activities to improve its tolerance to both biotic and abiotic stresses, as well as its production in terms of quantity/quality, and to obtain cultivars with particular berry characteristics (shape and colour). During my Thesis I participated in the development of an experimental MAGIC (Multiparent Advanced Generation InterCross) genetic population to study the relationships between genes/alleles and phenotype. The creation of a MAGIC population allows the collection of more complete genetic information, as it combines the genes of several parents in a single population. This advanced intermediate crossing process produces individuals with greater genetic variability than a classic population developed by crossing only two parents. The MAGIC population in question was obtained by crossing 8 parents of C. annuum (two blocky types, a red and a yellow Lamuyo, a snack type, a red bullhorn, a topepo and a friggitello), for 3 generations, to obtain a population of 348 individuals (G3 generation), recombinant for the founders' genotypes. The genome of the 8 parents was re-sequenced using Illumina technology (at an average depth of 30X) and analysed by bioinformatics analysis. An average of 600 M reads (2x150 PE) were obtained, cleaned for high quality (Q>20). Sequences were aligned, generating 8 .bam files, which compared with samtools (mpileup, http://www.htslib.org) allowed the identification of ~23.9M SNPs and ~1.5M indels, then annotated with SnpEff (http://pcingola.github.io/SnpEff); Delly (https://github.com/dellytools/delly) permitted the identification of ~1.2M structural variants (SVs). Genomic analysis was accompanied by phenotyping of the parental lines and the G3 generation for several quantitative and qualitative traits, on whose data statistical distributions were calculated, within the G3 population. In general, while a great deal of variability was not found qualitatively (i.e., berry colour), great diversity was observed for quantitative data (i.e., berry shape and yield). Furthermore, the resistance/susceptibility of the parents and G3 population was investigated for the viral pathogens CMV, TMV, PMMV P1.2, P1.2.3, PVY0 and TSWV. Alongside these activities, a GC-MS analysis of the metabolites responsible for the flavour of the berry in peppers (Beany, Grassy and Fruity) was carried out on the founders. The results show a marked variability for both organoleptic aspects and for two compounds (2-methoxy-3-(2-methylpropyl)-pyrazine and 2-Hexenal), probably related to the degree of ripeness and type of cultivation. The plants derived from the eight-way cross will be self-fertilised for a further two to three generations and genotyping by GBS (Genotyping By Sequencing) and phenotyping will be carried out on the resulting progeny (G5 or G6). To this end, a BSA-seq (Bulked Segregant Analysis sequencing) approach will be used to identify the genomic regions involved in the individual traits of interest. The results will allow the development of markers on genes of interest associated with valuable population traits, which will facilitate MAS (Marker-Assisted Selection) in future breeding programmes.
Il peperone (Capsicum annuum L; 2n=2x=24, genoma: ~3,5 Gb) appartiene alla famiglia delle Solanacee, ed è una specie ortiva coltivata in tutto il mondo sia per fini alimentari (consumo fresco) che per la trasformazione industriale, grazie all’elevato contenuto in vitamine e metaboliti secondari. La coltura è stata oggetto di molteplici attività di breeding per migliorarne la tolleranza sia a stress biotici che abiotici, così come la produzione dal punto di vista quanti/qualitativa, e per ottenere varietà con particolari caratteristiche della bacca (forma e colore). Durante la mia tesi di laurea ho partecipato allo sviluppo di una popolazione genetica sperimentale di tipo MAGIC (Multiparent Advanced Generation InterCross), al fine di studiare le relazioni tra geni/alleli e il fenotipo. La creazione di una popolazione MAGIC permette di accumulare informazioni genetiche più complete, poiché combina le forme alleliche di più genitori in una singola popolazione segregante. Questo approccio produce individui con una maggiore variabilità genetica rispetto a una classica popolazione sviluppata mediante incrocio tra solo due genitori. La popolazione MAGIC in questione è stata ottenuta incrociando 8 parentali di C. annuum (due tipologie blocky, un Lamuyo rosso e uno giallo, una tipologia da snack, un corno di toro rosso, un topepo e un friggitello), per 3 generazioni, fino ad ottenere una popolazione di 348 individui (generazione G3), ricombinanti per i genotipi dei fondatori. Il genoma degli 8 parentali è stato ri-sequenziato mediante la tecnologia Illumina (ad una profondità media di 30X) e analizzato tramite analisi bioinformatiche. In media, sono state ottenute 600 M di sequenze (2x150 PE), poi ripulite per elevata qualità (Q>20). Le sequenze sono state allineate, sul genoma di riferimento permettendo di identificare ~29,8M SNP e ~1,5M indel, poi annotati con SnpEff (http://pcingola.github.io/SnpEff); in parallelo sono state identificate ~1,2M variazioni strutturali (SV) utilizzando Delly (https://github.com/dellytools/delly). All’analisi genomica è stata affiancata la fenotipizzazione dei parentali e della generazione G3 per una serie di caratteri quantitativi e qualitativi, sui cui dati sono state calcolate le distribuzioni statistiche, entro la popolazione in G3. In generale, se dal punto di vista qualitativo non si è riscontrata una grande variabilità (e.g. colore della bacca), una grande diversità è stata osservata per i dati quantitativi (e.g.: forma della bacca e resa). Inoltre, è stata analizzata la resistenza/suscettibilità dei parentali e della popolazione G3, per i patogeni virali CMV, TMV, PMMV P1.2, P1.2.3, PVY0 e TSWV. A margine, sui parentali, è stata condotta un’analisi GC-MS dei metaboliti responsabili del sapore della bacca in peperone (Beany, Grassy e Fruity). I risultati mostrano una variabilità marcata sia per gli aspetti organolettici che per due composti (2-methoxy-3-(2-methylpropyl)-pyrazine e 2-Hexenal) probabilmente legati al grado di maturazione e al tipo di coltivazione. Le piante derivate dall’incrocio a otto vie saranno autofecondate per altre due/tre generazioni e sulla progenie ottenuta (G5 o G6) sarà condotta una genotipizzazione, tramite GBS (Genotyping By Sequencing), e una fenotipizzazione. Si prevede di utilizzare un approccio BSA-seq (Bulked Segregant Analysis sequencing) per identificare le regioni genomiche coinvolte nei singoli caratteri d’interesse e lo sviluppo di marcatori che faciliteranno la MAS.
Costruzione di una popolazione MAGIC (Multiparent Advanced Generation InterCross) in peperone: analisi genomica e fenotipica
GIANOGLIO, NIKE
2021/2022
Abstract
Il peperone (Capsicum annuum L; 2n=2x=24, genoma: ~3,5 Gb) appartiene alla famiglia delle Solanacee, ed è una specie ortiva coltivata in tutto il mondo sia per fini alimentari (consumo fresco) che per la trasformazione industriale, grazie all’elevato contenuto in vitamine e metaboliti secondari. La coltura è stata oggetto di molteplici attività di breeding per migliorarne la tolleranza sia a stress biotici che abiotici, così come la produzione dal punto di vista quanti/qualitativa, e per ottenere varietà con particolari caratteristiche della bacca (forma e colore). Durante la mia tesi di laurea ho partecipato allo sviluppo di una popolazione genetica sperimentale di tipo MAGIC (Multiparent Advanced Generation InterCross), al fine di studiare le relazioni tra geni/alleli e il fenotipo. La creazione di una popolazione MAGIC permette di accumulare informazioni genetiche più complete, poiché combina le forme alleliche di più genitori in una singola popolazione segregante. Questo approccio produce individui con una maggiore variabilità genetica rispetto a una classica popolazione sviluppata mediante incrocio tra solo due genitori. La popolazione MAGIC in questione è stata ottenuta incrociando 8 parentali di C. annuum (due tipologie blocky, un Lamuyo rosso e uno giallo, una tipologia da snack, un corno di toro rosso, un topepo e un friggitello), per 3 generazioni, fino ad ottenere una popolazione di 348 individui (generazione G3), ricombinanti per i genotipi dei fondatori. Il genoma degli 8 parentali è stato ri-sequenziato mediante la tecnologia Illumina (ad una profondità media di 30X) e analizzato tramite analisi bioinformatiche. In media, sono state ottenute 600 M di sequenze (2x150 PE), poi ripulite per elevata qualità (Q>20). Le sequenze sono state allineate, sul genoma di riferimento permettendo di identificare ~29,8M SNP e ~1,5M indel, poi annotati con SnpEff (http://pcingola.github.io/SnpEff); in parallelo sono state identificate ~1,2M variazioni strutturali (SV) utilizzando Delly (https://github.com/dellytools/delly). All’analisi genomica è stata affiancata la fenotipizzazione dei parentali e della generazione G3 per una serie di caratteri quantitativi e qualitativi, sui cui dati sono state calcolate le distribuzioni statistiche, entro la popolazione in G3. In generale, se dal punto di vista qualitativo non si è riscontrata una grande variabilità (e.g. colore della bacca), una grande diversità è stata osservata per i dati quantitativi (e.g.: forma della bacca e resa). Inoltre, è stata analizzata la resistenza/suscettibilità dei parentali e della popolazione G3, per i patogeni virali CMV, TMV, PMMV P1.2, P1.2.3, PVY0 e TSWV. A margine, sui parentali, è stata condotta un’analisi GC-MS dei metaboliti responsabili del sapore della bacca in peperone (Beany, Grassy e Fruity). I risultati mostrano una variabilità marcata sia per gli aspetti organolettici che per due composti (2-methoxy-3-(2-methylpropyl)-pyrazine e 2-Hexenal) probabilmente legati al grado di maturazione e al tipo di coltivazione. Le piante derivate dall’incrocio a otto vie saranno autofecondate per altre due/tre generazioni e sulla progenie ottenuta (G5 o G6) sarà condotta una genotipizzazione, tramite GBS (Genotyping By Sequencing), e una fenotipizzazione. Si prevede di utilizzare un approccio BSA-seq (Bulked Segregant Analysis sequencing) per identificare le regioni genomiche coinvolte nei singoli caratteri d’interesse e lo sviluppo di marcatori che faciliteranno la MAS.| File | Dimensione | Formato | |
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