Caratterizzazione biochimica e biofisica di un nuovo enzima lipasi della nocciola: la proteina di trasferimento lipidico non specifico Cor-a 8

L'irrancidimento nella frutta a guscio è facilitato o catalizzato da molti fattori fisici e biologici, tra cui diverse classi di enzimi come le lipasi, le lipossigenasi e le polifenolossidasi giocano un ruolo fondamentale. Le lipasi sono presenti nei tessuti di riserva di molte piante oleaginose e della frutta secca, dove contribuiscono principalmente alla mobilitazione della riserva di olio dopo la germinazione, ma di solito non sono attive nei semi a riposo e intatti. Le lipasi idrolizzano i trigliceridi liberando acidi grassi liberi che subiscono reazioni di ossidazione più facilmente di quelli esterificati e causano la formazione dei prodotti di degradazione volatili responsabili dei cattivi sapori. L'identificazione, la caratterizzazione molecolare e la comprensione dell'attività delle lipasi potrebbero rappresentare uno strumento predittivo innovativo nella produzione industriale per progettare strategie convenienti al fine di preservare le proprietà sensoriali e nutrizionali delle nocciole. Precedenti studi condotti dal gruppo di Biochimica del Dipartimento di Scienza e Tecnologia del Farmaco dell'Università di Torino hanno dimostrato che l'estratto di nocciola possiede un'attività idrolitica. Nella purificazione dell'estratto, una singola proteina sembra essere responsabile di questa idrolisi. È stata eseguita un'analisi di massa di questa proteina e la sequenza è stata attribuita a una proteina di 9 kDa denominata Cor-a 8 (da Corylus Avellana). In questo contesto, il progetto ha mirato alla caratterizzazione biochimica e biofisica della nuova lipasi Cor-a 8 presente nella nocciola. Inoltre, il gene della lipasi di C. avellana (Cor-a 8) è stato clonato ed espresso utilizzando E. coli come ospite eterologo. Il nuovo enzima lipasi ricombinante era necessario per migliorare la caratterizzazione funzionale e strutturale della proteina. A questo scopo, la lipasi di nocciola è stata estratta applicando i classici protocolli biochimici di estrazione e purificazione. L'attività enzimatica della lipasi è stata testata su substrati sintetici usando diversi derivati 4-nitrofenilici e su substrati naturali (triacilglicerolo). I prodotti di idrolisi dei primi substrati sono stati rilevati mediante analisi spettrofotometrica, mentre i prodotti di idrolisi dei secondi substrati sono stati rilevati mediante cromatografia su strato sottile (TLC). Inoltre, la stabilità e l'attività della lipasi sono state monitorate modificando parametri chimici e fisici come la temperatura, l'interazione con i metalli, i tensioattivi e i sali. Cor-a 8 ha dimostrato di possedere un'attività lipasica che è stata influenzata dall'aumento della temperatura e in presenza di zinco. Anche Cor-a 8 ricombinante era attivo ma altamente instabile. Sono necessarie indagini più approfondite per chiarire il comportamento enzimatico di Cor-a 8.

Rancidity in nuts is facilitated or catalyzed by many physical and biological factors, among which different classes of enzymes such as lipases, lipoxygenases and polyphenoloxidases play a key role. Lipases are present in reserve tissues of many oilseed plants and nuts where they mostly contribute to post-germination oil reserve mobilization but are usually not active in the resting and intact seeds. Lipases hydrolyze triglycerides releasing free fatty acids that undergo oxidation reactions easier than esterified and causing the formation of the volatile degradation products responsible for the bad flavors. The identification, molecular characterization, and the comprehension of the lipase activity could represent an innovative predictive tool in the industrial production to design convenient strategies in order to preserve sensorial and nutritional properties in hazelnuts. Previous studies carried out by the Biochemistry group in the Department of Drug Science and Technology at the University of Turin have shown that hazelnut extract has hydrolytic activity. In purifying the extract, a single protein appears to be responsible for this hydrolysis. A mass analysis of this protein was performed, and the sequence was attributable to a protein of 9 kDa named Cor-a 8 (from Corylus Avellana). In this frame, this project aimed to the biochemical and biophysical characterization of the new lipase Cor-a 8 present in hazelnut. Moreover, the C. avellana lipase gene (Cor-a 8) was cloned and expressed using E. coli as heterologous host. The recombinant new lipase enzyme was necessary to improve with the functional and structural characterization of the protein. For this purpose, the hazelnut lipase was extract applying a classical biochemical extraction and purification protocols. Lipase enzymatic activity was tested on synthetic substrates using different 4-nitrophenyl acyl derivates as well as natural substrates (triacylglycerol). The hydrolysis products of the former substrates were detected by spectrophotometric analysis whereas the hydrolysis products of the latter substrates were detected by thin layer chromatography (TLC). Moreover, the lipase stability and activity were monitored changing chemical and physical parameters such as temperature, metals interaction, surfactants and salts. Cor-a 8 showed to have lipase activity that was affected by the increase of temperature and in the presence of zinc. The recombinant Cor-a 8 was active too but highly unstable. A more detailed investigation is required to elucidate Cor-a 8 enzymatic behavior.