Approcci innovativi di reverse genetics in Solanum melongena L. : genome editing mediato da ribonucleoproteine e Virus-induced gene silencing.

Solanum melongena L., is a plant cultivated worldwide and of interest not only for its food but also for its industrial and pharmaceutical uses. The aim of this thesis is to demonstrate the effectiveness of virus-induced gene silencing (VIGS) and ribonucleoprotein (RNP)-mediated genetic transformation of protoplasts as reverse genetics approaches in this species. Despite both techniques being widely applied in many members of the Solanaceae family, their specific use in eggplant is still limited. The VIGS system, which exploits the ability of viruses to carry the silencing signal within the plant, was applied to silence the Chl gene encoding an enzyme involved in chlorophyll biosynthesis, whose silencing causes a chlorotic phenotype in the leaves. Two different viral vector inoculation techniques were evaluated: agroinoculation and rubbing cotyledons with infected sap. The latter was found to be more efficient based on the number of plants showing the expected phenotype and the gene silencing efficiency. This technique was therefore easily applicable in eggplant and was used for subsequent Virus-Induced Genome Editing (VIGE) experiments. This technique combines virus-induced silencing with CRISPR/Cas9-mediated genome editing. In this case, the specific gRNA sequence for the Chl gene was inserted into the pTRV1 and pTRV2 vectors, along with some RNAs capable of targeting the transcript to meristems and ensuring the heritability of the editing. Promising results were obtained, with observable phenotypic effects in the same plants that also showed good genomic editing efficiency. Ribonucleoproteins, on the other hand, formed by the Cas9 protein complexed with the gRNA complementary to the target gene, can be used to transform protoplasts, wall-less cells, to induce gene editing without any transgene integration. As targets, in addition to Chl, the Pds gene encoding the phytoene desaturase enzyme was chosen, which is important for chlorophyll protection against photobleaching. Protoplasts were isolated from eggplant cotyledons using two different protocols and then transfected with a plasmid containing the Green Fluorescent Protein (GFP) reporter gene to demonstrate transfection efficiency. Subsequently, they were transformed with ribonucleoproteins, and molecular analysis showed a very low editing efficiency, thus requiring further optimization of the protocol in future studies. Additionally, protoplast regeneration in alginate discs was evaluated under different culture conditions for four weeks, but no significant morphological developments related to protoplast regeneration were observed. This thesis work demonstrates the applicability of these transformation techniques in eggplant and provides the basis for future protocol improvements and applications.

La melanzana (Solanum melongena L.) è una pianta coltivata in tutto il mondo e di interesse non solo alimentare, ma anche industriale e farmaceutico. L’obiettivo del presente lavoro di tesi è quello di dimostrare l’efficacia del silenziamento genico indotto da virus (VIGS) e della trasformazione genetica di protoplasti mediata da ribonucleoproteine (RNP) come approcci di reverse genetics in questa specie. Infatti, nonostante entrambe le tecniche siano state ampiamente applicate in molti esponenti della famiglia delle Solanacee, il loro impiego specifico in melanzana è tutt’ora limitato. Il sistema VIGS, che sfrutta la capacità di diffusione dei virus di trasportare il segnale di silenziamento all’interno della pianta, è stato applicato per silenziare il gene Chl che codifica per un enzima coinvolto nella biosintesi della clorofilla e il cui silenziamento causa un fenotipo clorotico nelle foglie. Sono state valutate due diverse tecniche di inoculazione dei vettori virali: l’agroinoculazione e lo sfregamento dei cotiledoni con linfa infetta. Quest’ultima si è dimostrata più efficiente in base al numero di piante che hanno evidenziato il fenotipo atteso e all’efficienza di silenziamento genico. Tale tecnica è risultata quindi facilmente applicabile in melanzana, ed è stata utilizzata per i successivi esperimenti di Virus induced genome editing (VIGE). Tale tecnica combina il silenziamento indotto dal virus con il genome editing mediato da CRISPR/Cas9. In questo caso, all’interno dei vettori pTRV1 e pTRV2 è stata inserita la sequenza del gRNA specifico per il gene Chl legato con alcuni RNA capaci di indirizzare il trascritto ai meristemi e garantire l'ereditabilità dell’editing. Sono stati ottenuti risultati promettenti, con effetti fenotipici osservabili, nelle stesse piante che presentavano anche una buona efficienza di editing genomico. Le ribonucleoproteine, invece, formate dalla proteina Cas9 complessata con il gRNA complementare al target genico, possono essere utilizzate per trasformare i protoplasti, cellule prive di parete, per indurre un editing genetico senza alcuna integrazione del transgene. Come target, oltre a Chl, è stato scelto il gene Pds, codificante per l’enzima fitoene desaturasi, importante per la protezione della clorofilla dal fenomeno del photobleaching. I protoplasti sono stati isolati da cotiledoni di melanzana tramite due diversi protocolli e poi trasfettati con un plasmide contenente il gene reporter Green Fluorescent Protein (GFP) per dimostrare l’efficienza di trasfezione. Successivamente sono stati trasformati con ribonucleoproteine e dall’analisi molecolare è risultata un efficienza di editing molto bassa, rendendo quindi necessaria un’ulteriore ottimizzazione futura del protocollo. Inoltre, è stata valutata la rigenerazione dei protoplasti in dischi di alginato in diverse condizioni di coltura per quattro settimane, ma non è stato possibile osservare sviluppi morfologici significativi legati alla rigenerazione dei protoplasti. Questo lavoro di tesi dimostra quindi l'applicabilità di queste tecniche di trasformazione in melanzana e fornisce le basi per futuri miglioramenti dei protocolli e applicazioni.