Formulazione e caratterizzazione di nanoparticelle lipidiche rivestite di calcio fosfato

Bioceramics, including calcium phosphate (CaP) compounds, are innovative biocompatible, bio-inert, biodegradable and bioactive materials used for reparation and regeneration of bones and teeth in case of pathologies or mechanical damages. Thanks to their chemical and structural analogy to bone and dental tissues, they are able to stimulate a specific cellular response on a molecular level promoting osteoinduction due to the colonization of the material by cells that carry out a biodegradation and absorption [1]. In addition to the application of CaP derivatives in the coating of bone prostheses and dental implants, its utility has been hypothesized also as a coating of drug delivery nanosystems in case of bone diseases or for diagnostic procedures. This project aims to formulate lipid nanoparticles (NP) with suitable characteristics (net surface charge, shape and sizes) to generate a coating with CaP salts by electrostatic interactions on them. Initially, two different approaches have been hypothesized: the development of NP with negative surface charge (NPNEG) and NP with positive surface charge (NPPOS) using as charge agents long chain fatty acids and stearylamine respectively. In both cases the systems have been prepared with the microemulsion cold dilution technique [2] which involves the preparation of a microemulsion formed by a solid lipid dissolved in a partially soluble organic solvent, by a mixture of surfactants/co-surfactants and by an aqueous phase and its subsequent dilution with a 2% aqueous solution of Pluronic® F68 which determines the precipitation of lipid nanoparticles. The surface charge determination led to the exclusion of NPNEG and to the choice of NPPOS for the subsequent coating phase with calcium phosphate (CaP). A coating method reported in the literature [3] was adopted (method 1), which provides the addition of equal aliquots of CaCl2 and H3PO4 aqueous solutions to the suspension of NPPOS under continuous magnetic stirring. Subsequently, the procedure was optimized (method 2) by introducing a preliminary NP purification by gel filtration, by inserting two dialysis processes before and after the coating phase, by adding alternately small fractions of calcium and phosphate solutions and constantly maintaining the pH at 8.2. The coated NP were characterized by observation with optical and scanning electron microscope, by determination of the average diameter and of the Zeta potential. To assess the presence of CaP deposition on the surface, the NP have been subjected to observation with electronic transmission microscope (TEM), to microanalysis with EDS-TEM, to X-ray diffractometry and to FT-IR spectroscopy. This characterization evidenced as NP have spherical shape, sizes in the range 300-500 nm and as CaP is present in their elemental composition.

Le bioceramiche, tra cui i composti a base di calcio fosfato (CaP), sono materiali innovativi utilizzati per la riparazione, rigenerazione e ricostruzione ossea e dentale in seguito a patologie o danni meccanici. Infatti, grazie alla loro analogia chimica e strutturale con i tessuti ossei e dentali, sono in grado di stimolare una specifica risposta cellulare a livello molecolare promuovendo l'osteoinduzione in seguito alla colonizzazione del materiale da parte di cellule che attuano biodegradazione e assorbimento[1]. Oltre all'applicazione dei derivati del CaP nel rivestimento di protesi ossee e impianti odontoiatrici, ne è stata ipotizzata un'utilità come rivestimento di nanosistemi per il drug delivery in caso di patologie ossee o nella diagnostica. Questo progetto di tesi si è focalizzato sulla formulazione di nanoparticelle lipidiche (NP) aventi caratteristiche idonee (netta carica superficiale, forma e dimensioni) al rivestimento con sali di CaP mediante interazioni elettrostatiche. Inizialmente sono stati ipotizzati due differenti approcci che hanno previsto lo sviluppo di NP con carica superficiale negativa (NPNEG) e NP con carica superficiale positiva (NPPOS) utilizzando rispettivamente acidi grassi a lunga catena e stearilamina come agenti di carica. In entrambi i casi i sistemi sono stati preparati con la tecnica della diluizione a freddo di microemulsioni[2] che prevede la preparazione di una microemulsione formata da un lipide solido disciolto in un solvente organico parzialmente solubile in acqua, da una miscela di tensioattivi/cotensioattivi e da una fase acquosa e la sua successiva diluizione con una soluzione acquosa al 2% di PluronicF68 che comporta la precipitazione del lipide solido sotto forma nanoparticellare. La valutazione della carica superficiale di entrambi i tipi di NP ha portato ad escludere le NPNEG e a selezionare le NPPOS per la successiva fase di rivestimento con CaP. Inizialmente il rivestimento è stato creato adottando una metodica (1) riportata in letteratura [3] secondo cui alla sospensione di NPPOS vengono aggiunte pari aliquote di soluzioni acquose di CaCl2 e di H3PO4, sotto continua agitazione magnetica. Successivamente tale procedura è stata ottimizzata (metodica 2) introducendo una purificazione preliminare del campione nanoparticellare mediante gel-filtrazione, inserendo prima e dopo il rivestimento due processi di dialisi, aggiungendo le soluzioni di calcio e fosfato a piccole frazioni in modo alternato e mantenendo costantemente il pH a 8,2. Le NP rivestite sono state caratterizzate mediante osservazione al microscopio ottico e al microscopio elettronico a scansione, determinazione del diametro medio e del potenziale Zeta. Per valutare l'avvenuta deposizione del CaP sulla superficie, le NP rivestite sono state sottoposte ad osservazione al microscopio a trasmissione elettronica, a microanalisi EDS-TEM, a diffrattometria a raggi X e a spettroscopia FT-IR. Tale caratterizzazione ha evidenziato come le NP rivestite utilizzando la metodica 2 abbiano una forma sferica, dimensioni nel range 300-500nm e come sia presente il calcio e il fosfato nella loro composizione elementare.