Use of a PI3Kγ mimetic peptide to restore the CFTR localization at the plasma membrane.
Lo standard terapeutico per la fibrosi cistica (FC), una malattia ancora potenzialmente fatale, è rappresentato da Kaftrio (ETI), una combinazione di Elexacaftor, Tezacaftor e Ivacaftor, modulatori del regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR), un canale ionico che controlla l’idratazione del muco nelle vie aeree, mutato in questa patologia. Questo farmaco è indicato principalmente per i pazienti con la mutazione F508del, la più comune nella malattia, ma è stato approvato negli Stati Uniti anche per altre mutazioni che hanno dimostrato un miglioramento nel trasporto del cloruro in vitro. Nonostante la sua efficacia clinica, ETI riesce a ripristinare solo il 50% dell'attività del canale F508del-CFTR rispetto ai livelli del canale wild-type, evidenziando così la necessità di individuare nuove molecole in grado di ripristinare completamente la funzione del canale, al fine di ottenere un beneficio terapeutico più completo.
In questo contesto, il nostro studio mira a esplorare come e in che misura il peptide mimetico della fosfoinositide 3-chinasi γ (PI3Kγ) (PI3Kγ MP), una molecola brevettata in precedenti studi dal gruppo della Prof.ssa Ghigo, potenzi l'efficacia della terapia ETI elevando i livelli di adenosina monofosfato ciclico (cAMP). È noto infatti che, l’efficacia dei modulatori è migliorata dall’aumento dei livelli di cAMP nelle vicinanze del canale CFTR che ne promuove sia la fosforilazione sia la stabilizzazione sulla membrana plasmatica (PM) attraverso l’ancoraggio al citoscheletro.
Tramite misurazioni in camera di Ussing in cellule primarie bronchiali eterozigoti per l’allele F508del, abbiamo dimostrato che il trattamento combinato di ETI e PI3Kγ MP porta ad un aumento del 25% dell'attività totale del CFTR rispetto al solo ETI in termini di flusso di ioni cloruro, suggerendo una maggiore densità di CFTR sulla PM. Questa ipotesi è stata confermata da esperimenti di biotinilazione di superficie e pulldown con streptavidina che hanno rivelato come la combinazione di PI3Kγ MP ed ETI porti ad un aumento significativo della quantità di CFTR corretto localizzato sulla PM. Inoltre, esperimenti con cicloesimide (CHX) hanno dimostrato che PI3Kγ MP raddoppia la stabilità della forma corretta del F508del-CFTR, suggerendo come il peptide possa agire da stabilizzatore del canale, prolungandone l'emivita sulla PM. Per investigare i meccanismi molecolari alla base di questo effetto stabilizzante, abbiamo condotto un'analisi fosfoproteomica che ha identificato la proteina chinasi D1 (PKD1), nota per il suo ruolo nel riciclaggio e nell’endocitosi delle proteine di membrana, come principale target modulato da PI3Kγ MP. Abbiamo dimostrato che la sua inibizione farmacologica blocca l'aumento della presenza di F508del-CFTR in membrana indotto dal trattamento combinato con PI3Kγ MP ed ETI, confermando il ruolo cruciale di questa chinasi nella stabilizzazione del canale. Inoltre, la fosforilazione e attivazione di PKD1 da parte di PI3Kγ MP richiedono la collaborazione di PKA e PKC, suggerendo che il meccanismo d’azione del peptide coinvolge la modulazione del complesso multiproteico del cAMP, orchestrato da AKAP-Lbc, per la fosforilazione e stabilizzazione del CFTR. I nostri risultati indicano che l’utilizzo di potenziali agenti stabilizzanti specifici come il nostro peptide offra nuove opportunità per migliorare l’efficacia delle terapie modulatorie nella FC.
The therapeutic standard for cystic fibrosis (CF), a potentially fatal disease, is represented by Kaftrio (ETI), a combination of Elexacaftor, Tezacaftor, and Ivacaftor, modulators of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an ion channel that controls mucus hydration in the airways, mutated in this pathology. This drug is primarily indicated for patients with the most common mutation in the disease, the F508del, but in the United States it has also been approved for other mutations that have demonstrated improved chloride transport in vitro. Despite its clinical benefits, ETI restores only 50% of the F508del-CFTR channel activity compared to wild-type levels, highlighting the need to identify new compounds that can fully restore channel function to achieve more complete therapeutic benefits.
In this context, our study aims to explore how and to what extent the phosphoinositide 3-kinase γ (PI3Kγ) mimetic peptide (PI3Kγ MP), designed by the team of Prof. Ghigo in previous studies, enhances the effectiveness of ETI therapy by elevating cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels. It is known that the potency of modulators is improved by increased cAMP levels near the CFTR channel, promoting both its phosphorylation and stabilization at the plasma membrane (PM) through cytoskeleton anchoring.
Using Ussing chamber assays on primary bronchial cells heterozygous for the F508del allele, we demonstrated that the combination of ETI and PI3Kγ MP boosts total CFTR activity by 25% compared to ETI alone in terms of chloride ion flow, suggesting a higher density of CFTR at the PM. This hypothesis was confirmed by surface biotinylation and streptavidin pulldown experiments, which revealed that the combined treatment leads to a significant increase in the amount of corrected CFTR present on the PM. Furthermore, cycloheximide (CHX) experiments showed that PI3Kγ MP doubles the stability of the corrected F508del-CFTR form, indicating that the peptide may act as a stabilizer of the channel, prolonging its half-life at the membrane.
To investigate the molecular mechanisms driving this stabilization, we performed a phosphoproteomic analysis that identified protein kinase D1 (PKD1), a key regulator of membrane protein recycling and endocytosis, as the main target modulated by PI3Kγ MP. We demonstrated that pharmacological inhibition of PKD1 blocks the increase in F508del-CFTR presence on the membrane induced by the combined treatment with PI3Kγ MP and ETI, confirming the pivotal role of this kinase in CFTR stabilization. Moreover, the phosphorylation and activation of PKD1 by PI3Kγ MP require the cooperation of PKA and PKC, suggesting that the peptide's mechanism of action involves the modulation of the cAMP multiprotein complex, via AKAP-Lbc, to promote CFTR phosphorylation and stabilization. Our results indicate that the use of specific stabilizing agents, such as our peptide, offers new opportunities to improve the efficacy modulator-based therapies in CF.