L'inflammasoma NLRP3 è un complesso multiproteico ad alto peso molecolare, appartenente alla famiglia NLRs (NOD-like receptors), in grado di attivare la risposta immunitaria innata, mediante la liberazione delle interleuchine proinfiammatorie IL-1β e IL-18 attraverso l'attivazione della caspasi-1.1
L'innesco dell'inflammasoma NLRP3 è inoltre un evento chiave della cascata piroptotica, un processo di morte cellulare programmata implicata nella patogenesi di molte malattie autoinfiammatorie e di altre malattie caratterizzate da eccessiva morte cellulare e infiammazione (come le malattie infiammatorie croniche intestinali - IBD).
Data la scarsa efficacia delle terapie attualmente in atto per fronteggiare i sintomi delle IBD, la comunità scientifica si è attivata per cercare nuovi possibili target, verso i quali indirizzare l'azione dei futuri farmaci al fine di ottenere benefici dai trattamenti. In particolare la nostra ricerca si è rivolta verso derivati elettrofili, reattivi secondo Michael, in grado di bloccare l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3, inibendolo in modo irreversibile.
I derivati sono stati così progettati per legarsi in modo covalente in una tasca idrofobica ad azione ATPasica presente nel dominio NACHT della proteina NLRP3. I composti oggetto di questa tesi sono stati ottenuti attraverso la modulazione farmaco-chimica di una molecola modello precedentemente individuata denominata INF4E.2 INF4E, non era ottimale per utilizzo in modelli in vivo in quanto mostrava una certa citotossicità. Sono quindi state analizzate le quattro porzioni della molecola responsabili della reattività e delle proprietà farmacologiche (l'anello benzenico o-cloro-sostituito, l'ossidrile in posizione benzilica, la sottostruttura elettrofila ed il residuo terminale estereo) modulandole, mediante O-sostituzione, rimozione del gruppo OH, idrolisi e legando all'anello benzenico un ulteriore cloro in para, si è ottenuta una serie di tredici composti. L'analisi di questi composti per verificarne la misura della reattività con nucleofili solforati (cysteamine chemoassay), la misura della citotossicità (saggio colorimetrico MTT), la misura dell'inibizione dell'attività ATPasica di NLRP3 (saggio ADP Glo) e la misura dell'attività antipiroptotica (saggio LDH), ha consentito di identificare il composto INF39 privo di citotossicità e quindi più adatto ai test in vivo. L'utilizzo di INF39 in un modello di colite DNBS-indotta nel ratto ha portato ad un notevole miglioramento del quadro infiammatorio paragonabile a quello ottenuto con il desametaone senza però effetti collaterali sul peso corporeo.
Bibliografia:
(1) Schroder, K.; Tschopp, J. The Inflammasomes. Cell 2010, 140 (6), 821¿832.
(2) Cocco, M.; Garella, D.; Di Stilo, A.; Borretto, E.; Stevanato, L.; Giorgis, M.; Marini, E.; Fantozzi, R.; Miglio, G.; Bertinaria, M. Electrophilic warhead-based design of compounds preventing NLRP3 inflammasome-dependent pyroptosis. J. Med. Chem. 2014, 57 (24), 10366¿10382.
The NLRP3 inflammasome is a multiproteic complex belonging to the NLRs family (NOD-like receptors). The NLRP3 inflammasome is able to activate the innate immune response causing the release of proinflammatory interleukins(IL) such as IL-1β and IL-18, through the activation of caspase-1. NLRP3 inflammasome activation is mediated by PAMPs (pathogen-associated molecular patterns) and DAMPs (danger-associated molecular pattern). The activation of NLRP3 is also responsible, through the cleavage of Gasdermin-D protein, of a programmed cell death process, named pyroptosis.1
This process is involved in the pathogenesis and progress of many autoinflammatory diseases and other diseases characterized by inflammation and excessive cell death such as inflammatory bowel diseases-IBD.
In recent year, due to the lack of any efficient therapy to resolve IBD, scientists started to search for new pharmacological targets. Our team turned its interest towards the design of electrophilic derivatives (Michael-type acceptors), able to inhibit the NLRP3 inflammasome activation. In a first proof of concept work, some electrophilic derivatives were developed. One of the synthesized compounds (INF4E) was able to efficiently prevent NLRP3-triggered pyroptotic cell death at low micromolar concentration.2 Unfortunately, INF4E showed also a certain cytotoxicity, therefore it was not suitable for further in vivo studies. In this work, we applied pharmaco-chemical design to modulate the structure of INF4E in order to obtain compounds suitable for in vivo studies. Compounds were designed with the aim of covalently bind in a hydrophobic pocket located in the NACHT domain of the NLRP3 protein, which is endowed with ATPase activity. Four molecular patterns, responsible for the reactivity and the pharmacological properties, were identified in the model compound INF4E: (i) the o-chloro-substitued benzene ring, (ii) the benzilic hydroxyl group, (iii) the reactive α,β-unsaturated ester, and (iv) the ester group. These moieties were chemically modulated through (i) O-substition, (ii) OH-removal, (iii) hydrolysis, and (iv) benzene ring substitution. A series of thirteen compounds was obtained. Compounds were tested to assess their reactivity with nucleophilic sulfurated reagents (cysteamine chemoassay), their cytotoxicity in human macrophages (MTT assay), their ability to inhibit NLRP3 ATPase activity (ADP Glo assay), and their antipyroptotic properties (LDH assay). INF39 was identified as the best performing compound suitable for in vivo studies. Finally, INF39 proved able to alleviate the outcome of colitis in a rat model of DNBS-induced colitis after oral administration. Its effect was similar to that obtained after dexamethasone administration, but devoid of negative effects on body weight typical of the steroidal drug.
References:
(1) Schroder, K.; Tschopp, J. The Inflammasomes. Cell 2010, 140 (6), 821¿832.
(2) Cocco, M.; Garella, D.; Di Stilo, A.; Borretto, E.; Stevanato, L.; Giorgis, M.; Marini, E.; Fantozzi, R.; Miglio, G.; Bertinaria, M. Electrophilic warhead-based design of compounds preventing NLRP3 inflammasome-dependent pyroptosis. J. Med. Chem. 2014, 57 (24), 10366¿10382.