Il lavoro di biotipizzazione di 157 ceppi di O. oeni, isolati da
vino Nebbiolo della zona di Neive e Barbaresco, è stato svolto
utilizzando la comparazione di 2 metodi molecolari basati sulla PCR
(Polymerase Chain Reaction), utilizzati al fine di ottenere la
separazione in cluster dei ceppi in esame.
I ceppi studiati provengono da un precedente lavoro di
caratterizzazione su batteri isolati da 3 fermentazioni malolattiche
(FML) avvenute spontaneamente su vini Nebbiolo. Questo lavoro ha
permesso di individuare come unico responsabile delle 3 FML O. oeni.
I batteri apparteneti alla specie O. oeni sono molto interessanti
per la moderna enologia, infatti, sono i responsabili delle FML che
avvengono nei vini. O. oeni è un batterio lattico Gram positivo e
catalasi negativo, ed ha metabolismo eterofermentativo. Le cellule
hanno forma coccica e diametro di 0,5-0,7 μm, unite in coppie o
catenelle. Sono mesofili, cioè hanno temperatura ottimale di
sviluppo tra 20° e 30° C. Sono i principali responsabili della FML
in vino poiché sono in grado di resistere alle condizioni del vino:
basso pH ed elevata concentrazione di etanolo ed SO2.
La FML è una tappa molto importante della vinificazione, soprattutto
per i vini rossi, in particolar modo per i grandi rossi da
invecchiamento a cui sicuramente appartiene il Nebbiolo. La FML è la
degradazione dell'acido malico in acido lattico ed anidride
carbonica da parte di O. oeni. Questo metabolismo apporta numerose
modificazioni al vino, in primo luogo si ha un calo dell'acidità
titolabile ed un aumento del pH. I batteri lattici sono inoltre in
grado di metabolizzare l'acido citrico con produzione di acido
acetico (responsabile del leggero aumento dell'acidità volatile
durante la FML), diacetile, acetoino, 2,3-butandiolo, questi ultimi
sono i responsabili di modificazioni olfattive importanti, poiché
hanno soglia olfattiva molto bassa, con profumi di burro e
mandorle..
I metodi PCR presi in esame nello svolgimento del presente lavoro
sono la rep-PCR e la Sau-PCR. Il primo è basato sull'utilizzo di
primers specifici che corrispondono a sequenze ripetute all'interno
del DNA batterico in regioni non codificanti. Il secondo metodo si
basa su due reazioni successive. La prima reazione è operata
dall'enzima di restrizione Sau3AI, che ha lo scopo di tagliare il
DNA batterico in piccoli frammenti. La seconda reazione è
l'amplificazione PCR dei frammenti tagliati dall'enzima.
I risultati ottenuti dalle corse elettroforetiche sono rielaborati
utilizzando un programma di analisi statistica (BioNumerics) al fine
di ottenere un dendrogramma. Il dendrogramma riunisce i ceppi in
gruppi in funzione del grado di similarità delle corse
elettroforetiche. Utilizzando BioNumerics sono stati uniti in un
unico dendrogramma i risultati avuti con i 2 metodi utilizzati,
ottenendo i risultati migliori. In questo caso utilizzando un
coefficiente di similarità del 70%, si sono ottenuti 10 gruppi di
ceppi e 2 ceppi separati, .
Dallo studio dei dendrogrammi in funzione del giorno di
campionamento e della provenienza, si evince che i ceppi tendono a
raggruppare in base al giorno di campionamento e non in funzione
della provenienza.
L'obiettivo per il futuro è la caratterizzazione fisiologica di
alcuni ceppi di O. oeni per ogni gruppo di ceppi derivato dalla
cluster analysis, in particolare di ceppi isolati durante la fase
intermedia e finale delle FML, poiché più probabili responsabili
della FML.
In this work of biotypisation of 157 strains of O. oeni isolated
from Nebbiolo wine in the area of Neive and Barbaresco, 2 molecular
methods were used, based on PCR (Polymerase Chain Reaction), to
obtain a cluster separation of the strains.
The strains examined came from a previous work of isolation and
identification of bacteria isolated from 3 spontaneous malolactic
fermentation (MLF), in Nebbiolo wines. This work allowed to
individualize how unique responsable of the 3 MLF were the bacteria
O. oeni.
The bacteria of the species O. oeni are the most important for the
modern oenology, infact, they are the responsibles of MLF in wine.
O. oeni is a lactic acid bacterium, Gram positive and negative
catalase, with eterofermentative metabolism, it degrades the glucose
in lactic acid as principal product and carbon dioxide, ethanol and
acetic acid. The cells have a form of cocci and diameter of 0,5-0,7
μm, united in couples or small chains. The optimal temperature of is
development between 20° and 30° C. The O. oeni are the principal
responsable of the MLF in wine, because they are resistant at the
harsh environmental conditions of wines: low pH and high
concentration of ethanol and SO2.
The MLF is an important stage of winemaking process, above all for
red wine, especially for the ageing red wine like the Nebbiolo
wines. The MLF entails the decarboxylation of malic acid to lactic
acid and carbon dioxide. This metabolism results in a decrease in
total acidity and an increase of pH. The lactic acid bacteria are
in a position also to metabolize the citric acid with production of
acetic acid (responsable of a increase of volatile acidity during
the MLF), diacetyl, acetoin and 2,3-butanediol, the 3 last molecules
are responsible of important flavour modification, because their
flavour threshold is very low, whit flavour of butter and almond.
The PCR methods used in this work were the rep-PCR and the Sau-PCR.
The first method is based on the use of specific primers that
correspond to sequences in the bacterial DNA in repeated non coding
area. The second method is based on two following reactions. The
first reaction is operated from restriction enzyme Sau3A, for the
purpose of cutting the bacterial DNA in short fragments. The second
reaction is the PCR amplification of the fragments cut from the
enzyme.
The results obtained from the electrophoresis run were elaborated
with a computer program of statistical analysis (BioNumerics) to the
purpose of obtaining a dendrogram. The dendrogram gather the groups
based on the degree of similarity of the electrophoresis run. Using
a coefficient of similarity of 70%, were obtained 10 groups of
strains and 2 separated strains.
From the dendrograms obtained it was seen that strains grouped in
clusters based on the day of isolation and not the source (MLF) of
isolation. Furthermore, it was seen that strains isolated in the
middle and end of the fermentation were present in the wine from the
beginning and only started to multiply later during fermentation.
The objective for the future is the physiological characterization
in wine of some strains of O. oeni for every group derived from the
cluster analysis, particularly of the strains isolated during the
half and finish MLF, because most probably they are responsible for
the MLF.