The development of novel bioelectrochemical methods based on CYPs as tools for their characterization and for high-throughput screening application, despite its importance, is difficult to set up due to CYPs poor interaction with electrode surfaces. In this regards, crucial issues are the achievement of efficient electron transfer to the electrode surface, stability and solubility of human CYPs protein, development of immobilization methods which allow to achieve an efficient and stable interaction electrode-enzyme. Here, in order to obtain an efficient electron transfer between CYP2D6 and the electrode surface and to make human CYP self sufficient, soluble and stable, using the ¿Molecular Lego¿ approach, the heme domain of CYP2D6 was combined with the flavodoxin from Desulfovibrio vulgaris. Moreover, at the C-terminus of CYP2D6-FLD construct was inserted a peptide anchor containing cysteine residues​​, in order to take advantage of linkage between their thiol groups and the gold surface, and therefore to obtain a direct oriented connection protein-electrode preventing enzyme denaturation, thus obtaining an electrochemically and electrocatalytically active enzyme-eletrode system. From GATR-FTIR characterization it was found that direct immobilization of CYP2D6-FLD-4G2C on gold electrodes was successful: the enzyme was linked to gold electrode retaining the correct folding, and the presence of the peptide -4G2C linker at the C-terminal of the construct CYP2D6-FLD affected this linkage. Through cyclic voltammetry and square wave voltammetry it has been further demonstrated that CYP2D6-FLD-4G2C is effectively linked to the gold electrode and electroactive. The electrocatalysis experiment followed by the HPLC injection of reaction solutions showed that the enzyme bound to the gold electrode is electrocatalytically active, being able to to metabolize metoprolol in α-hydroxymetoprolol and O-demethylmetoprolol. Regarding α-hydroxymetoprolol formation there is an effect of cooperativity in metoprolol binding in the active site of the enzyme: the enzyme follow the Hill kinetic model for allosteric enzymes, with h, Vmax and K' values, respectively 1.5 ± 0.2, 0.27 ± 0.02 nmol/min and 132.2±17.2 µM. Instead, regarding O-demethylmetoprolol formation the enzyme follow the Michaelis-Menten kinetic model, with values of Vmax and KM of 0.023±0.005 nmol/min and 144.5 ± 59.4 µM. Looking at the overall results, it can be concluded that CYP2D6FLD-4G2C direct immobilization strategy on gold electrodes was successful: the enzyme is effectively immobilized, has retained the correct fold and is electrically and electrocatalytically active. This strategy can thus be used for the development of bioelectrodes based on CYPs, in view of a future application in medical field as high-throughput screening tool of new drugs or chemical entities. Moreover the development of bioelectrodes based on CYP2D6 could be very interesting, given the large involvement of this enzyme in the metabolism of many common drugs together with the high degree of polymorphism of this specific CYP isoform: CYP2D6 based bioelectrodes would be of high relevance for the design of effective drug therapies, reducing adverse drug reactions and offering optimized therapeutic strategy for future personalized treatment.
Lo sviluppo di metodi bioelectrochimici basati sui CYP come strumenti per la loro caratterizzazione e per applicazioni di high-throughput screening è difficile da realizzare a causa della scarsa interazione di tali enzimi con la superficie degli elettrodi. I principali problemi sono il conseguimento di un efficiente trasferimento di elettroni alla superficie dell'elettrodo, la stabilità e la solubilità dei CYP umani e lo sviluppo di metodi di immobilizzazione che consentano di realizzare un'interazione elettrodo-enzima efficiente e stabile. Al fine di ottenere un efficiente trasferimento di elettroni tra CYP2D6 e la superficie dell'elettrodo e di rendere CYP umano autosufficiente, solubile e stabile, utilizzando l'approccio "Molecular Lego" il dominio emico del CYP2D6 è stato combinato con la flavodossina da Desulfovibrio vulgaris; al C-terminale del costrutto CYP2D6-FLD è stato poi inserito un linker peptidico contenente residui cisteinici, al fine di sfruttare il collegamento tra i loro gruppi tiolici e la superficie d'oro, e quindi di ottenere una connessione diretta e orientata proteina-elettrodo, impedendo la denaturazione dell'enzima, che dovrà essere elettrochimicamente ed electrocataliticamente attivo. Dalla caratterizzazione GATR-FTIR è emerso che l'immobilizzazione diretta di CYP2D6-FLD-4G2C su elettrodi d'oro ha avuto successo: l'enzima è legato all'elettrodo, ha mantenuto il fold corretto e il peptide -4G2C al C-terminale ha influenzato tale legame. Attraverso voltammetria ciclica e voltammetria ad onda quadra è stato ulteriormente dimostrato che CYP2D6-FLD-4G2C è effettivamente legato all'elettrodo d'oro ed elettroattivo. Tramite l'esperimento di elettrocatalisi seguito dall'iniezione all'HPLC delle soluzioni di reazione è stato dimostrato che l'enzima è legato all'elettrodo d'oro ed electrocataliticamnete attivo, essendo in grado di metabolizzare il metoprololo in α-idrossimetoprololo e O-demetilmetoprololo. Per quanto riguarda la formazione di α-idrossimetoprololo c'è un effetto di cooperatività nel legame del metoprololo nel sito attivo dell'enzima, il quale segue la cinetica di Hill per enzimi allosterici, con valori di h, Vmax e K ', rispettivamente, 1,5±0,2, 0,27±0,02 nmol/min e 132,2±17,2 µM. Per quanto riguarda la formazione di O-demetilmetoprololo l'enzima segue il modello cinetico di Michaelis-Menten, con valori di Vmax e KM di 0,023±0,005 nmol/min e 144,5±59,4 µM. Dai risultati ottenuti si può concludere che la strategia di immobilizzazione diretta di CYP2D6FLD-4G2C su elettrodi d'oro ha avuto successo: l'enzima è immobilizzato, ha mantenuto il fold corretto ed è elettricamente ed electrocataliticamente attivo. Questa strategia può quindi essere utilizzata per lo sviluppo di bioelettrodi basati sui CYP, in vista di una futura applicazione in campo medico come strumenti per high throughput di screening di nuovi farmaci o entità chimiche. Inoltre lo sviluppo di bioelettrodi basati su CYP2D6, dato il grande coinvolgimento di questo enzima nel metabolismo di molti comuni farmaci insieme all'elevato grado di polimorfismo di questa specifica isoforma, potrà essere di grande rilevanza per la progettazione di terapie farmacologiche efficaci, per la riduzione delle reazioni avverse al farmaco e per lo sviluppo di strategie terapeutiche ottimali per il futuro trattamento personalizzato.