Il lavoro sperimentale svolto ha previsto una fase primaria di caratterizzazione e studio conoscitivo del principio attivo farmaceutico Trilostano, a cui ha fatto seguito, una volta ritenuto soddisfacente tale studio preliminare, lo sviluppo, l'ottimizzazione e la pre-validazione di un metodo analitico indicativo di stabilità, mediante tecnologia HPLC, per l'analisi di tale principio attivo farmaceutico da utilizzare per la formulazione di un medicinale veterinario costituito da compresse a rilascio immediato di Trilostano, al fine di ottenere una formulazione sicura, efficace, stabile, di alta qualità e bioequivalente con il medicinale originator di riferimento Vetoryl® capsule rigide per cani da 10mg, 30mg, 60mg e 120mg. Per lo svolgimento dei test necessari alla pre-validazione sono state seguite le linee guida stabilite dai seguenti enti: - ICH Q2 (R1) - VICH GL2 – AEFI. Per la valutazione dei risultati, invece, riferimento è stato fatto ai criteri di accettabilità stabiliti dalle seguenti associazioni: AEFI- AOAC. Durante la pre-validazione del metodo sono stati valutati i parametri di Idoneità del sistema strumentale, Selettività, Linearità e Precisione, comprendente Ripetibilità e Precisione Intermedia del sistema strumentale e Ripetibilità del metodo. In particolare, lo studio di selettività ha richiesto lo sviluppo di uno stress-test in cui sono state valutate l'idrolisi, l'ossidazione, la fotolisi e la degradazione termica. Il principio attivo è stato sottoposto a varie condizioni di stress, al fine di misurare con precisione i cambiamenti nella concentrazione del farmaco, verificare l'assenza di interferenze con eventuali prodotti di degradazione, impurità ed eccipienti e per monitorare e prevedere come la stabilità del farmaco e del medicinale commercializzato possa subire variazione con il tempo e a seconda degli stressor a cui è sottoposto. Una efficace separazione del farmaco dai suoi prodotti di degradazione è stata ottenuta utilizzando una colonna cromatografica ZORBAX Eclipse XDB-C18 (4.6 × 150 mm, 5 µm). La fase mobile utilizzata è costituita da diverse proporzioni di acetonitrile e di una soluzione tampone di ammonio diidrogenofosfato 20 mM in gradiente di concentrazione; la temperatura della colonna è stata impostata a 25 °C, il flusso a 1 mL/min e la lunghezza d'onda di detenzione a 250nm. Nel lavoro di tesi è stata dimostrata l'Idoneità, la Ripetibilità e Precisione Intermedia del sistema strumentale, cosi come la Selettività del metodo, rispetto alla presenza di prodotti di degradazione, e la sua Ripetibilità. Il metodo proposto è risultato essere lineare nell'intervallo considerato tra il 70% ed il 130% della concentrazione di lavoro di 100 µg/ml, mentre il limite di quantificazione (LOQ) è stato fissato allo 0,5% di tale concentrazione di lavoro. I saggi condotti con le suddette condizioni cromatografiche sul principio attivo Trilostano hanno fornito risultati soddisfacenti e accettabili secondo i criteri di accettabilità considerati. Lo studio è stato in parte esteso alla pre-validazione, del metodo analitico sviluppato, sul medicinale costituita da compresse a rilascio immediato di Trilostano da 20mg e 80mg, ottenute per compressione diretta. È tuttavia in corso l'ottimizzazione della formulazione definitiva che permetterà di eseguire i test completi necessari alla Validazione finale del metodo analitico selezionato.
The experimental work carried out included a primary phase of characterization and knowledge of the active pharmaceutical substance Trilostane, which was followed, once considered satisfactory this preliminary study, by the development, optimization and pre- validation of a stability-indicating high-performance liquid chromatography method for analysis of the active pharmaceutical ingredient to be used for the formulation of a veterinary medicinal product consisting of immediate-release tablets of Trilostane, in order to obtain a safe, effective, stable, high quality and bioequivalent formula with the reference medicinal product Vetoryl® hard capsules for dogs of 10mg, 30mg, 60mg, and 120mg. For the pre-validation's tests the following guidelines have been followed: International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human use - ICH Q2 (R1) - VICH GL2 - AEFI
For the evaluation of the results, however, reference was made to the acceptance criteria established by the following associations: AEFI- AOAC-. During the pre-validation of the method, the instrumental system suitability, selectivity, linearity and precision, including repeatability and intermediate precision of the instrumental system and repeatability of the method, parameters were evaluated. In particular, the selectivity study required the development of a stress-test in which hydrolysis, oxidation, photolysis and thermal degradation were assessed, subjecting the active pharmaceutical ingredient to various stress conditions, in order to accurately measure changes in drug concentration, check for no interference with any degradation products, impurities and excipients and to monitor and predict how the stability of the drug and of the marketed formulation change with time and depending on the stressors to which it is subjected. Successful separation of drug from degradation products is achieved on a reversed-phase ZORBAX Eclipse XDB-C18 (4.6 × 150 mm, 5 µm) column. The mobile phase was gradient elution of acetonitrile and 20 mM ammonium dihydrogen phosphate buffer; column temperature was set at 25 °C, the flow rate at 1 mL/min and the detection wavelength at 254 nm.
The suitability, repeatability and intermediate precision of the instrumental system, as well as the selectivity of the method with respect to the presence of degradation products, and its repeatability have been demonstrated. The proposed method was linear in the range considered between 70% and 130% of the working concentration of 100 µg/ml, while the limit of quantification (LOQ) was set at 0.5% of this working concentration. Tests with the above chromatographic conditions on the drug, Trilostane, provided satisfactory and acceptable results according to the acceptance criteria considered.
The study was partly extended to pre-validation of the analytical method developed on the marketed formulation, consisting of immediate-release tablets of Trilostane 20mg and 80mg, obtained by direct compression. However, the optimisation of the final formulation is underway, which will allow the complete tests necessary for the final validation of the selected analytical method.