L'infezione da HIV, il virus responsabile dell'AIDS, è una delle patologie più studiate negli ultimi anni. Uno dei maggiori traguardi raggiunti è stata l'introduzione della terapia HAART. Essa consiste nella somministrazione ai pazienti di più farmaci antiretrovirali simultaneamente: questo consente di ottenere una buona soppressione della replicazione virale, ostacolando allo stesso tempo l'insorgenza di fenomeni di farmacoresistenza. L'accesso alle terapie ha consentito di ridurre la mortalità, migliorare le condizioni di vita dei soggetti sieropositivi e contenere la diffusione dell'epidemia, anche grazie all'introduzione della PREP, la profilassi pre-esposizione: questa prevede il trattamento terapeutico di soggetti sani, ma ad elevato rischio di contrarre l'infezione.
La terapia HAART presenta dunque innumerevoli benefici, ma solo se scrupolosamente seguita. Si stima infatti che la causa principale di fallimento terapeutico sia la mancata aderenza ad esso da parte dei pazienti. Per tale motivo è stato introdotto il monitoraggio della terapia, caratterizzato dall'esecuzione di opportune analisi di laboratorio, volte ad accertare la presenza dei farmaci nei fluidi biologici dei pazienti: come risultato si ottengono dati oggettivi, dai quali il medico può trarre importanti informazioni e procedere di conseguenza modificando la terapia in corso, se necessario.
Diverse sono le tipologie di fluidi biologici che possono essere impiegate per il monitoraggio. Tra queste, la saliva sta ricevendo un'attenzione sempre crescente, grazie alla semplicità e non invasività del prelievo, che la rendono particolarmente gradita ai pazienti e adeguata all'utilizzo nel caso di patologie croniche come l'infezione da HIV.
In questo lavoro di tesi si è scelta appunto la saliva come materiale biologico per la determinazione del Tenofovir, uno dei farmaci antiretrovirali più frequentemente prescritti come costituenti di regimi HAART e PREP. Si tratta di un inibitore nucleotidico della transcrittasi inversa virale, somministrato sotto forma di due profarmaci: TDF, tenofovir disoproxil fumarato, e TAF, tenofovir alafenamide. Entrambi vengono assunti oralmente una volta al giorno.
La tecnica analitica prescelta è un saggio immunichimico di tipo “ELISA”. Rispetto al più tradizionale HPLC-MS, i metodi immunochimici presentano costi ridotti e la possibilità di essere successivamente convertiti in test rapidi, particolarmente adatti all'impiego anche nei paesi in via di sviluppo.
Il lavoro sperimentale ha previsto inizialmente la selezione di un anticorpo monoclonale anti-tenofovir da utilizzare per l'esecuzione del test. Successivamente, si sono eseguite una serie di prove per determinare le concentrazioni di reattivi da impiegare nel saggio. Dopo uno studio dell'effetto matrice, si è proseguito con la definizione di una curva di calibrazione in soluzione tampone, necessaria per l'esecuzione di un'analisi quantitativa di un campione reale. Infine, si è eseguita la validazione del metodo analitico, andando a valutare l'imprecisione, in termini di ripetibilità e riproducibilità, l'inaccuratezza, mediante un test di recupero, e la selettività dell'anticorpo nei confronti dell'analita target rispetto ad analoghi strutturali.
HIV infection, the virus causing AIDS, is one of the most studied diseases during the last years. One of the greatest achievements was the introduction of HAART therapy. It consists of administering multiple antiretroviral drugs to patients simultaneously: this leads to good suppression of viral replication, while at the same time hindering the onset of drug resistance phenomena. Access to therapies reduced mortality, improved the living conditions of HIV-positive subjects and contained the spread of the epidemic, thanks to the introduction of PREP, pre-exposure prophylaxis: this provides for the therapeutic treatment of health subjects, but at a high risk of getting the infection.
HAART therapy has therefore many benefits, but only if it is strictly followed. In fact, it is estimated that the main cause of therapeutic failure is the lack of adherence to it by patients. For this reason, therapeutic drug monitoring was introduced. It is characterized by the execution of appropriate laboratory analysis, in order to verify the presence of drugs in the biological fluids of patients: as a result, objective data are obtained, from which the doctor can draw important information and proceed consequently modifying the current therapy, if necessary.
Several types of biological fluids can be used for monitoring. Among these, saliva is receiving ever-increasing attention, thanks to the simplicity and non-invasiveness of the sampling procedure, which makes it particularly appreciated by patients and suitable for use in chronic diseases such as HIV infection.
In this work, saliva was chosen as the biological material for the determination of Tenofovir, an antiretroviral drug frequently prescribed as constituents of HAART and PREP regimens. It is a NRTI, nucleotide reverse transcriptase inhibitor, administered in the form of two prodrugs: TDF, tenofovir disoproxil fumarate, and TAF, tenofovir alafenamide. Both are taken orally daily.
We chose an “ELISA” immunoassay as analytical technique. Compared to the more traditional HPLC-MS methods, immunochemical methods are cheaper and may subsequently be converted into rapid tests, particularly suitable for use even in developing countries.
The experimental work initially involved the selection of an anti-tenofovir monoclonal antibody to be used for the test. Subsequently, a series of tests were performed to determine the concentrations of reactants to be used in the assay. After a study of the matrix effect, we continued with the definition of a calibration curve in buffer solution, necessary in order to perform quantitative analysis of a real sample. Finally, the validation of the analytical method was performed, evaluating imprecision, in terms of repeatability and reproducibility, inaccuracy, by means of a recovery test, and selectivity of the antibody towards the target analyte compared to structural analogues.