Optimization of the Second-Tier Test Method in Neonatal Screening.
Lo screening neonatale è un programma di medicina preventiva nato negli anni ’60 negli Stati Uniti e diffusosi successivamente in tutto il mondo. L’obiettivo dello screening neonatale è quello di andare a individuare precocemente la presenza di malattie metaboliche ereditarie nei neonati. Queste malattie, se non vengono diagnosticate tempestivamente, possono causare gravi danni fisici e/o mentali, fino al decesso del neonato. Per questo motivo, la diagnosi precoce consente di migliorare significativamente la qualità di vita dei pazienti e delle loro famiglie, perché permette di intraprendere un trattamento specifico.
Inizialmente, il pannello metabolico indagato con lo screening neonatale consisteva solamente di tre malattie, ovvero la fenilchetonuria, l’ipotiroidismo congenito e la fibrosi cistica, per poi passare a indagare oltre 50 malattie del metabolismo a trasmissione autosomica recessiva. La possibilità di ampliare il numero di malattie indagabili è stata resa possibile grazie all’introduzione della spettrometria di massa tandem, portando allo sviluppo dello screening neonatale esteso (SNE) che permette di individuare un numero maggiore di analiti e patologie con una sola analisi.
Inoltre, la spettrometria di massa tandem ha consentito di sviluppare dei test di secondo livello (Second-tier Test), che sono dei test che vengono eseguiti sullo stesso cartoncino prelevato alla nascita nei casi di sospetto allo SNE. Utilizzando lo stesso cartoncino della nascita si va a diminuire lo stato di ansia nelle famiglie e si va a ridurre il numero di falsi positivi riscontrati nei test di primo livello.
L’utilizzo della spettrometria di massa tandem nei Second-tier test permette di identificare gli isomeri o le sostanze interferenti, migliorando la specificità, oppure di quantificare nuovi analiti più specifici per una data patologia. Tra gli analiti quantificati ai 2ndTT abbiamo l’acido metilmalonico (MMA) che viene quantificato per l’individuazione dell’acidemia metilmalonica classica, l’acido etilmalonico (EMA) per la diagnosi di SCAD e GA II, l’acido metilcitrico (MCA) per la diagnosi di acidemia propionica, l’omocisteina (HCY) per l’individuazione di omocistinuria classica o di acidemia metilmalonica con omocistinuria e la propionilglicina (PGC). In particolare, questi analiti vengono ricercati mediante i Second-tier test quando ai test di primo livello sono stati riscontrati valori anomali di C3, C4 e Metionina.
I Second-tier test vengono eseguiti mediante LC-ESI-MS/MS, ovvero gli analiti vengono prima separati mediante una cromatografia liquida, ionizzati mediante una ionizzazione elettrospray e gli ioni generati vengono separati all’interno uno spettrometro di massa che lavora in modalità MRM, ovvero multiple reaction monitoring. In questa modalità i due analizzatori di massa lavorano in modalità statica: nel primo analizzatore viene selezionato un unico ione precursore che viene frammentato nella cella di collisione e il secondo analizzatore tra tutti i frammenti generati seleziona un unico ione prodotto che sarà il responsabile del segnale.
L’obiettivo di questo lavoro è quello di ottimizzare i metodi dei Second-tier test impiegati dal laboratorio di screening prenatale e neonatale del Piemonte e della Valle d’Aosta e di armonizzare le procedure di laboratorio, in modo tale da rendere gli strumenti analitici intercambiabili. Inoltre, su uno dei due strumenti analitici utilizzati in questo progetto è stata introdotta la Flow Injection Analysis, andando a bypassare la colonna cromatografica, permettendo un’analisi più veloce ed economica.
Neonatal screening is a preventive medicine program that originated in the 1960s in the United States and subsequently spread throughout the world. The objective of neonatal screening is to identify early the presence of hereditary metabolic diseases in newborns. If these diseases are not diagnosed promptly, they can cause serious physical and/or mental damage, even leading to the death of the newborn. For this reason, early diagnosis significantly improves the quality of life of patients and their families, as it allows for specific treatment to be initiated.
Initially, the metabolic panel investigated with neonatal screening consisted of only three diseases, namely phenylketonuria, congenital hypothyroidism, and cystic fibrosis, and then expanded to investigate over 50 metabolic diseases with autosomal recessive transmission. The possibility of expanding the number of investigable diseases was made possible by the introduction of tandem mass spectrometry, leading to the development of expanded neonatal screening (ENS), which allows for the identification of a greater number of analytes and pathologies with a single analysis.
Furthermore, tandem mass spectrometry has made it possible to develop second-tier tests, which are tests performed on the same card collected at birth in cases of suspicion in the ENS. Using the same birth card reduces anxiety in families and reduces the number of false positives found in first-level tests.
The use of tandem mass spectrometry in second-tier tests allows for the identification of isomers or interfering substances, improving specificity, or for the quantification of new analytes that are more specific for a given pathology. Among the analytes quantified in 2ndTT, we have methylmalonic acid (MMA), which is quantified for the identification of classic methylmalonic acidemia, ethylmalonic acid (EMA) for the diagnosis of SCAD and GA II, methylcitric acid (MCA) for the diagnosis of propionic acidemia, homocysteine (HCY) for the identification of classic homocystinuria or methylmalonic acidemia with homocystinuria, and propionylglycine (PGC). In particular, these analytes are investigated by second-tier tests when abnormal values of C3, C4, and Methionine have been found in the first-level tests.
Second-tier tests are performed using LC-ESI-MS/MS, meaning the analytes are first separated by liquid chromatography, ionized by electrospray ionization, and the generated ions are separated within a mass spectrometer that works in MRM mode, or multiple reaction monitoring. In this mode, the two mass analyzers work in static mode: in the first analyzer, a single precursor ion is selected, which is fragmented in the collision cell, and the second analyzer, among all the fragments generated, selects a single product ion that will be responsible for the signal.
The objective of this work is to optimize the methods of the second-tier tests used by the prenatal and neonatal screening laboratory of Piedmont and Valle d'Aosta and to harmonize laboratory procedures, so as to make the analytical instruments interchangeable. Furthermore, on one of the two analytical instruments used in this project, Flow Injection Analysis was introduced, bypassing the chromatographic column, allowing for faster and more economical analysis.