Nel presente lavoro di tesi sono stati analizzati 71 casi di carcinoma a cellule squamose del distretto cervico-facciale. Al fine di analizzare la correlazione tra la presenza del genoma di HPV e lo sviluppo di questa classe di carcinomi sono state eseguite analisi mediante Nested-PCR. Il DNA di HPV è stato riscontrato in 10 casi su 71, ovvero nel 14% dei campioni analizzati. Un solo campione è risultato co-infettato da HPV16 e HPV33, mentre i restanti 9 sono risultati positivi solo all'infezione da HPV16. Successivamente, la carica virale è stata determinata nei 10 campioni tumorali HPV-positivi, mediante Real-Time RT-PCR quantitativa. I risultati ottenuti hanno evidenziato una grande variabilità, con un range di 7.4*10-4 e 4.56 copie di HPV16 per cellula e il valore più alto è stato rilevato in un carcinoma orofaringeo. Sono stati quindi eseguiti studi di associazione con altri parametri clinici e sierologici, estrapolati dai database dei pazienti. E' emerso che la presenza del DNA virale tende ad essere correlata con il consumo di tabacco dei pazienti. Nella coorte dei forti fumatori (38%), nessuno è risultato HPV-positivo mentre in coloro che sono stati classificati come fumatori leggeri (meno di 20 sigarette giornaliere) e nei non fumatori, HPV è stato trovato in un numero significativo di pazienti rispettivamente 7% e 3% (P=0.0518). Sono state inoltre condotte analisi di tipo genetico, per quanto concerne il polimorfismo del gene che codifica per la proteina oncosoppressore p53. Come riportato dalla letteratura, p53 può essere legata e degradata dalla oncoproteina E6 di HPV16. La suscettibilità della proteina p53 nei confronti di questa proteina virale potrebbe essere influenzata dal polimorfismo del codone 72 del gene p53. I 71 campioni tumorali sono stati processati mediante Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) per individuare i polimorfismi a carico del codone 72 del gene di p53. Sui campioni analizzati non è stata riscontrata nessuna correlazione tra i polimorfismi dell'esone 4, codone 72, del gene p53 e sede tumorale, grado di differenziamento tumorale, classificazione TNM, sesso, consumo di alcool e tabacco. La maggior parte dei tumori HPV-positivi presenta eterozigosi del tipo Prolina/Arginina a livello del codone 72 del gene p53.
Infine per analizzare il ruolo dell'infezione da HPV direttamente nel contesto del microambiente tumorale, è stata effettuata un'analisi immunoistochimica sui 22 casi di carcinoma a cellule squamose dell'orofaringe. Non è stata riscontrata alcuna differenza statisticamente significativa tra tumori positivi e negativi per HPV per quanto riguarda l'infiltrazione tumorale da parte di cellule CD25+, FoxP3+, CD3+, C68+, CD20+, CD8+ e CD4+. La carica virale è stata valutata per verificare se questa potrebbe influenzare il fenotipo dei TILs nel gruppo di carcinomi dell'orofaringe HPV16-positivi. I valori della carica virale di HPV16 uguali o superiori a 10-1 copie per cellula sono risultati associati ad una maggiore densità di cellule infiltranti il tumore CD3+ e FOXP3+.
In conclusione, questo studio ha evidenziato il coinvolgimento di HPV16 nell'eziopatogenesi dei carcinomi squamosi dell'orofaringe, come induttore di una forte risposta infiammatoria, che lo portano pertanto ad essere considerato un valido marcatore prognostico positivo di tale patologia.
In the present study we analyzed 71 patients affected by HNSCC. In order to investigate the relationship between the presence of the HPV genome and the tumor development we assessed PCR protocols, such as Nested-PCR, followed by DNA sequencing. HPV DNA was detected in 10 of 71 cases, corresponding to 14% of the samples analyzed. Sequencing revealed all 10 HPV DNA-positive samples to be infected by HPV16, with only one case of co-infection by HPV16 and HPV33. Oropharyngeal carcinomas turned out to have the highest HPV incidence, with 9 out of 22 cases (41%) positive for HPV16.
The 10 HPV-positive tumors were analyzed by quantitative Real-Time RT-PCR, to determine the viral load values. The results showed great variability, ranging between 7.4*10-4 and 4.56 HPV16 copies per cell, with the highest value detected in an oropharyngeal carcinoma. Patient's databases were then analyzed to find associations with other clinical and serological parameters. No correlations were found between gender, age at diagnosis, TNM classification, grading of differentiation and HPV infection. A significant correlation was observed between the smoking history and the presence of HPV-DNA: in the cohort of heavy smokers (defined as smoking more than 20 cigarettes a day), no case of HPV infection was found. Only in patients with a smoking history of less than 20 cigarettes a day (7 cases, classified as light smokers) and in non-smokers (3 cases) HPV DNA was found (P=0.0518). To assess the association between HPV and p53 polymorphism in our cohort of patients, we performed genetic analysis. It is well known that the tumor suppressor protein p53 may be bound and degraded by HPV16 E6 oncoprotein. The susceptibility of p53 to the HPV16 oncoprotein may be influenced by the p53 codon 72 polymorphism. To analyze the p53 status, p53 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) analysis was performed on all 71 tumor specimens. Worthy of note, a significant association was observed between p53 codon 72 polymorphism and the presence of HPV: the majority of HPV-positive tumors displayed a Proline/Arginine allele at codon 72 of the p53 gene. However, no correlations were found between p53 polymorphism genotype and tumor site, grading, TNM staging or any other clinical-pathological feature.
Finally, in attempt to analyze the role of HPV infection directly in the context of tumor microenvironment, immunohistochemical analysis was performed on 22 cases of oropharyngeal squamous cell carcinoma. No difference was found in the extent of tumor infiltration by CD25+, FoxP3+, CD3+, C68+, CD20+, CD8+ or CD4+ cells in HPV-positive versus HPV-negative tumors. Viral loads were determined in the HPV16-positive oropharyngeal carcinomas in an attempt to verify whether they were related with the phenotype of TILs present. HPV16 load values equal or greater than 10-1 copies per cell were associated with higher density of tumor infiltrating CD3+ and FoxP3+ cells.
In conclusion, this study highlighted the involvement of HPV16 in HNSCCs in triggering a stronger immune response and the virus may be considered a reliable marker for the clinical staging and a more favorable prognosis of oropharyngeal carcinoma.