Alterazioni nel profilo dei miRNA (miRNA) sono associate a numerose patologie fra cui cancro e malattie cardiovascolari. I miRNA sono una classe di piccoli RNA che alterano l'espressione post-trascrizionale dei loro RNA messaggeri target attraverso meccanismi di inibizione della traduzione e/o degradazione dell'mRNA. Nella presente tesi l'attenzione è stata rivolta agli effetti della sovraespressione del miR-214 in un modello sperimentale di topo geneticamente modificato prodotto e utilizzato dal gruppo di ricerca guidato dalla Prof. Taverna (MBC, Torino) per la ricerca sul cancro. Dagli studi condotti è emerso come la progressione tumorale e la capacità metastatica di melanomi o tumori al seno sia promossa dalla sovraespressione di questo miRNA, attraverso la modulazione di un nuovo pathway che coinvolge oltre 70 geni codificanti e altri miRNA. In particolare, il miR-214 è in grado di up-regolare l'espressione di ALCAM attraverso il silenziamento del suo target TFAP2 e di un altro piccolo RNA, il miR-148b, entrambi inibitori di ALCAM. Generando animali sovraesprimenti il miR-214 è risultato evidente che questo miR ha un ruolo ulteriore in aggiunta all'intervento nelle neoplasie. I topi sono in grado di sopravvivere e riprodursi ma hanno un peso corporeo inferiore rispetto ai WT, una durata della vita media ridotta e sviluppano alterazioni strutturali a carico di vari organi come reni, milza e fegato. La presenza in questi organi di accumuli extracellulari di materiale proteico apparentemente amorfo porta a ipotizzare che la sovraespressione del miR-214 a livello sistemico determini l'insorgenza di amiloidosi multi-organo.
La sperimentazione condotta nel Lab. di fisiologia cardiovascolare del dipartimento di Scienze della Vita e Biologia dei Sistemi si è incentrata sulla possibile identificazione e caratterizzazione di alterazioni del tessuto cardiaco. I cuori prelevati dagli animali (6 sovraesprimenti il miR e 6 WT), sono stati fissati, inclusi, congelati e tagliati mediante criostato in sezioni di 50 μm e marcati con colorazione ematossilina-eosina o studiati con tecniche di immunofluorescenza. Le osservazioni in microscopia ottica e confocale (114 in totale) hanno evidenziato la presenza di infiltrati cellulari, accumuli extracellulari di materiale proteico apparentemente amorfo, disorganizzazione del tessuto muscolare e presenza di nuclei anomali negli animali sovraesprimenti il miR, generalmente assenti nei topi WT. L'esatta composizione e origine di questi depositi è tutt'ora in fase di analisi. Tuttavia, in alti organi, il gruppo della Prof. Taverna ha potuto osservare una sovraespressione di SAA2, un prodotto proteico della fase infiammatoria acuta implicata nell'amiloidosi reattiva e ulteriori esperimenti sono necessari per determinare se la natura dei depositi osservati nel cuore è analoga. Misurazioni effettuate su 120 cellule (60 da topi sovraesprimenti il miR e 60 WT) hanno mostrato come i cardiomiociti dei topi sovraesprimenti il miR mostrino una lunghezza significativamente minore e una larghezza significativamente superiore rispetto ai WT. Inoltre, analisi sulle dimensioni assolute e relative dei cuori hanno mostrato come frequentemente nei topi sovraesprimenti il miR-214 si riscontri un ingrossamento dell'organo. Ulteriori ricerche porteranno a una migliore conoscenza della biologia di questo miR e degli effetti patologici anche slegati dalle neoplasie associati alle alterazioni dei network di regolazione cui partecipa.
Alterations in the microRNA (miRNA) profiles are often linked to a number of pathologies including cancer and cardiovascular diseases. miRNAs are class of short RNAs that alters their target messenger RNAs post-transcriptional expression by degrading them or by translational inhibition.
In this thesis project we focalized on the effects carried out by the over-expression of the miR-214 in a genetically modified mouse model developed by the research group led by Prof. Daniela Taverna (MBC Torino) during a research on cancer. The studies conducted on this disease uncovered that the over expression of this miRNA promotes tumour progression and metastatic ability of melanomas and breast cancers through a novel pathway that involves more than 70 coding genes and other miRNAs. MiR-214 over expression was shown to up regulate ALCAM expression through the silencing of its target TFAP2 and another small RNA, miR-148, both of which display an inhibitory effect on ALCAM expression. Generating the genetically modified mice overexpressing miR-214 it became evident that this miRNA plays another role in addition to the contribution to the tumour progression.
Mice are viable and fertile although they have lower body weight and a shorter median life compared to WT littermates and develop structural alterations in various organs, such as liver, spleen and kidney. The presence in these organs of aggregates of apparently amorphous material of protein origin leads to hypothesise that the systemic overexpression of the miR-214 may lead to the development of a multi-organ amyloidosis.
The experimental work done in the cardiovascular physiology laboratory in the Life Sciences and System Biology Department has been centred on the potential identification and characterization of alterations developed in the mice heart. After fixation, inclusion and freezing, hearts explanted from sacrificed animals (6 with miR-214 overexpression and 6 WT) have been cut with a cryostat to obtain 50 µm sections. These slices were next stained with hematoxylin-eosin or using fluorescence techniques. Observations under optical and confocal microscope (114 in total) showed the presence of alterations such as cellular infiltrates, accumulation of apparently-amorphous material of protein origin, disorganization of the muscle tissue and the presence of anomalous nuclei in the cardiac tissue of animals overexpressing the miRNA, that were generally absent in control mice. The exact composition of the extracellular deposits found is still under investigation. However an early proteomic analysis in other organs pointed out an overexpression of SAA2 (a proteic product involved in the acute phase of inflammation) that was previously shown to be involved in reactive amyloidosis. More experiment are needed to determine weather the deposits found in the heart are analogous to those found in other organs Measurements conducted on 120 cells (60 from mice with miR-214 overexpression and 60 from WT) showed that the cardiomyocytes of mice with miR-214 overexpression are significantly shorter and thicker than control littermates. In addition analysis of the absolute and relative heart size showed that overexpressing mice frequently show an organ enlargement. More research on this subject is needed that can provide a better knowledge either about this miRNA biology and the pathological effects, also unrelated to neoplasias, associated with the alterations of the regulation network it is involved in.